辣椒DNA甲基化修饰酶基因的鉴定与表达特征分析

2022-03-07张颖蔡小桃谢炳春韦丽丽徐小万张碧佩吴智明

热带作物学报 2022年2期

张颖　蔡小桃　谢炳春　韦丽丽　徐小万　张碧佩　吴智明

摘要：DNA甲基化与去甲基化是表观遗传修饰中一种保守的分子机制，参与植物生长发育、次生代谢和逆境胁迫响应等多种生物过程，受DNA甲基化修饰酶基因的调控。为了解DNA甲基化修饰酶基因在辣椒基因组中的特征，利用生物信息学手段鉴定出14个辣椒DNA甲基转移酶和去甲基化酶基因，并对其进行系统分析。结果表明：辣椒基因组中含10个DNA甲基转移酶和4个去甲基化酶基因，这些基因编码的氨基酸介于294～2037 aa之间，不均匀分布于除6号和11号染色体外的其余10条染色体上，基因所含的外显子数目在1～21之间，关系较近的基因拥有的保守域基本一致。组织特异性表达结果显示，和在所有组织的表达量均很低，而和在所有组织中表达量均较高。通过qPCR分析基因在高温和盐胁迫下的表达模式，对比高温处理的整个时期，发现处理3 h的材料中甲基化修饰酶基因表达量变化最明显，上调最高的基因分别为和;盐胁迫诱导下的材料在12 h处理时甲基化修饰酶基因最敏感，有9个基因表达量达到峰值，上调最高的基因分别为和。本研究为进一步揭示辣椒DNA甲基化修饰酶基因家族在表观遗传学中的调控作用提供理论参考。

关键词：辣椒;DNA甲基化;果实发育;非生物胁迫;表达分析

中图分类号：S813.3 文献标识码：A

Identification and Expression Analysis of the DNA Methyltransferase and Demethylase Gene Families in L.

ZHANG Ying CAI Xiaotao XIE Bingchun WEI Lili XU Xiaowan ZHANG Bipei WU Zhiming

1. College of Horticulture and Landscape Architecture， Zhongkai University of Agriculture and Engineering， Guangzhou， Guangdong 510225， China; 2. Vegetable Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences / Guangdong Key Laboratory for New Technology Research of Vegetables， Guangzhou， Guangdong 510640， China

DNA methylation or demethylation is a highly conserved epigenetic modification involved in the regulation of numerous biological processes， including plant growth and development， secondary metabolism， and response to abiotic stresses， which controlled by DNA methyltransferase and demethylase genes. To fully understand the characteristics of DNA methylation modifying enzyme genes in the pepper genome， a total of 10 putative DNA methyltransferase and 4 demethylase genes were identified in pepper in the present study by using bioinformatics methods. The amino acids encoded by the genes were between 294–2037 AA. The genes were located on 10 different chromosomes， the number of exons contained in the 14 genes is between 1 and 21. The conserved motif compositions and exon-intron structures were systematically analyzed， and the results strongly supported the classi?cation. Transcriptome data analysis proved that the expression levels of family member genes in different organs of pepper and different stages of fruit development were different. Among them， and showed the lowest expression in all organs， while and showed the highest. The expression pattern of genes under high temperature and salt stress was analyzed by qPCR. Compared with the whole period of high temperature treatment， it was found that the expression of methylation modifying enzyme gene changed most obviously in materials treated for 3 hours， and the genes with the highest up-regulation were and ， respectively. The methylation modifying enzyme gene of the materials induced by salt stress was the most sensitive when treated for 12 hours， and the expression of 9 genes reached the peak， and the genes with the highest up-regulation were and. This study would provide a theoretical reference for further revealing the regulatory role of pepper DNA methylation modifying enzyme gene family in epigenetics.

pepper （ L.）; DNA methylation; fruit development; abiotic stress; expression

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.02.004

表观遗传（epigenetics）是指不依赖DNA序列的改变所产生的可遗传的变异，在动植物界均普遍存在。DNA甲基化（DNA methylation）与去甲基化（demethylation）是表观遗传修饰中最早发现且非常保守的分子机制之一，通过改变染色质结构、DNA构象、DNA稳定性或DNA与蛋白质的相互作用方式调控基因的表达。已有研究表明，植物DNA甲基化参与许多生物学过程的调控，在维持基因组稳定、组织器官的生长发育及响应胁迫应答等过程中均发挥了重要作用。

植物DNA甲基化修饰过程通常由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase）和DNA去甲基化酶（DNA demethylase）共同作用，前者主要包括甲基转移酶MET1（Methyltransferase 1）、染色质甲基化酶CMT3（Chromomethylase 3）和结构域重排甲基转移酶DRMs（Domain-rearranged methyltransferases）等，分别负责CG、CHG和CHH（H=A，C或T）的甲基化修饰。DNA去甲基化酶基因通常都含有保守的DNA糖苷酶结构域，属于DNA葡萄糖基酶（DNA glycosylases）家族，如DME（DEMETER）、DML2和DML3（DEMETER-like proteins 2 and 3）和沉默抑制子ROS1（Repressor of Silencing 1）等。基于基因组水平的生物信息学分析，目前研究者已分别从拟南芥、水稻、玉米、花生、丹参、番茄、茶和石斛等多种植物中鉴定出8～14个不等的DNA甲基化修饰酶基因，对这些基因功能的研究主要集中在模式植物如拟南芥、水稻和番茄中，基因突变后可引起拟南芥、水稻整个或部分基因组DNA甲基化水平发生改变。

辣椒（spp.）是重要的茄科蔬菜作物，原产于墨西哥和中南美洲，约在明朝末年经丝绸之路和东南亚海路传入我国。我国辣椒年播种面积超过200万hm，是种植面积最大的蔬菜种类之一。本研究团队前期运用甲基化敏感扩增多态性技术（methylation sensitive amplified polymorphism， MSAP）分析了一年生辣椒（ L.）和中華辣椒（ Jacq.）种间与种内DNA甲基化多样性，发现辣椒表观遗传十分丰富。同时分析了高温高湿胁迫下辣椒基因组DNA甲基化水平及状态的变化，推测DNA去甲基化可能是辣椒耐高温高湿的机制之一。最近也有研究表明，DNA甲基化修饰酶基因与植物激素相互作用，参与辣椒果实成熟的调控。其他有关辣椒DNA甲基化表观遗传调控的研究甚少。

2014年，韩国和中国研究团队连续完成了对辣椒基因组的测序，为后续辣椒应用基础研究提供了重要支撑。本研究通过生物信息学手段从辣椒基因组中鉴定DNA甲基转移酶和DNA去甲基化酶家族成员，对其结构、染色体定位、系统进化、蛋白质保守序列进行分析，并比较该基因家族在辣椒不同组织及在逆境处理下的表达模式，为进一步挖掘辣椒甲基化修饰酶基因的功能提供参考依据。

材料与方法

材料

供试材料为一年生辣椒（Capsicum annuum L.）栽培种‘遵辣1号’（Zunla-1），由遵义市农业科学院辣椒研究所提供。种子经浸泡过夜，28℃催芽，出芽后播种于装有专用育苗基质的50孔穴盘，待植株长至5～6片真叶，一批露地种植于仲恺农业工程学院教学科研基地，按常规栽培管理;另一批用于逆境处理试验。逆境试验选择长势良好且长势一致的植株，分别经42℃高温和200 mmol/L NaCl胁迫处理，以未经处理正常生长的材料作为对照（CK），处理后0、3、6、12 h采取辣椒叶片，每个处理10株，设3个生物学重复，液氮速冻后立即放入–80℃超低温冰箱保存备用。

方法

1.2.1 辣椒DNA甲基化修饰酶基因家族成员的鉴定在拟南芥基因组数据库（https：//www. arabidopsis.org/）搜索获得拟南芥中DNA甲基化修饰酶基因：（AT5G49160.1）、（AT1G80740.1）、（AT4G19020.1）、（AT1G69770.1）、（AT5G25480.1）、（AT5G15380.1）、（AT5G04560.2）、（AT3G10010.1）、（AT4G34060.1）和（AT2G36490.1），下载基因相应的蛋白质序列，在茄科植物基因组数据库（https：// solgenomics.net/marker/SGN-M8338/details）选择辣椒基因组蛋白质序列库（Zunla v2.0）进行BLASTP比对。利用ProtParam（http：//web.expasy. org/protparam/）对甲基化修饰酶基因进行理化性质分析，预测等电点。

1.2.2 基因定位及结构分析从辣椒基因组网站获取DNA甲基化基因所在的染色体位置及染色体大小，利用MapChart 2.2制作染色体定位图。同时从数据库下载基因的DNA和cDNA序列，利用在线工具GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu. cn/）对甲基化修饰酶基因的结构进行展示。利用MEME（https：//meme-suite.org/meme/）在线分析软件分析蛋白质中的保守结构域。

1.2.3 构建系统进化树为研究DNA甲基化修饰酶基因的进化关系，从NCBI分别下载马铃薯、番茄等物种中相应基因的蛋白质序列，采用MEGA-X软件内置的Clustal W软件对蛋白序列进行多重比对，默認软件本身参数设置。使用邻接法（neighbor-joining method，NJ）构建系统进化树，并对构建的系统进化树进行自检，bootstrap值设为1000。

1.2.4 组织特异性表达特征分析利用辣椒基因组测序中获得的转录组数据集，分析辣椒甲基化修饰酶基因的表达特征，其中包含‘遵辣1号’辣椒不同组织（根、茎、叶、花和不同时期的果实等）所有注释基因的表达数据。转录本丰度用 FPKM（fragments per kilo bases per million reads）值表示。家族成员在不同组织中的FPKM值，取对数（logFPKM）进行转换，用TBtools绘制表达量热图。

1.2.5 RNA提取与qPCR表达分析采用试剂盒（华越洋）提取组织RNA。用1.5%普通琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，同时用核酸蛋白仪测定RNA的浓度。反转录合成cDNA并以此为模板，在CFX96 Connect实时定量PCR分析仪（Bio-Rad）上进行基因表达分析。扩增体系为25 μL：其中含100 ng/μL cDNA 2 μL，上下游引物（0.2 μmol/L）各0.5 μL，TB Green Ex Taq（TaKaRa公司）12.5 μL，ddHO 9.5 μL，扩增程序为：95℃预变性30 s;95℃变性5 s，60℃退火30 s，40个循环。用2法计算基因相对表达量，所得数据运用Origin软件作图。本研究所用qPCR引物见表1。

结果与分析

辣椒甲基化修饰酶基因的鉴定与分布

通过序列比对并去除重复，在‘遵辣1号’基因组中共鉴定获得14个DNA甲基化修饰酶基因（表2），包括10个DNA甲基转移酶基因和4个DNA去甲基化酶基因，分别是2个MET基因（和），3个CMT基因（、和），4个DRM基因（、CaDRM1-like1、和）和1个DNMT2基因（），

2个DME和DML基因（和）和2个ROS1基因（和）。这些基因编码蛋白质的氨基酸长度范围为294～2037 aa，CDS序列长度为885～5835 bp，等电点在4.77～9.41之间。从基因在染色体上的分布看，除6号和11号染色体外，其余10条染色体均有分布（图1）。14个基因中有3个分布在12号染色体中，2个分布在1号染色体上，2个分布在10号染色体上，其余均单独分布在2号、3号、4号、5号、7号、8号和9号染色体上。

辣椒甲基化修饰酶基因的结构分析

利用GSDS 2.0和MEME结构域在线分析工具，得到辣椒甲基化修饰酶基因的结构和蛋白质Motif分析的分布图（图2、图3）。图2展示了基因的内含子与外显子，其中含有21个外显子，而仅有1个外显子。通过分析预测辣椒DNA甲基化修饰酶基因编码蛋白中的保守结构域可知，关系较近的基因拥有的保守域基本一致。如和同时包含motif2、moti4、motif5和motif9;和共同拥有motif2、moti4和motif9;而motif7和motif8仅在DRMs中出现，motif1、motif3、motif6和motif10仅在DNA去甲基化酶基因（和）中出现（图3）。保守motif的分布预示着辣椒的这些甲基化修饰酶基因进化过程相对保守。

辣椒甲基化修饰酶基因的系统进化分析

为探究辣椒和其他物种DNA甲基化修饰酶基因的同源进化关系，以拟南芥、辣椒、番茄和马铃薯中DNA甲基化修饰酶基因编码的蛋白质序列为材料，利用MEGA-X构建系统进化树（图4）。结果显示，辣椒基因组中的DNA甲基化修饰相关酶基因与拟南芥中该基因家族的分类结果一致。首先可将DNA甲基化修饰相关酶基因分为两大类，即I类DNA甲基转移酶基因和II类DNA去甲基化酶基因。DNA甲基转移酶基因家族可分为a、b、c和d四个亚家族，分别为DRMs、DNMT2、MET1和CMT3。DNMT2亚家族中的成员最少，仅包含1个基因（），CMT3亚家族中包含3个辣椒CMT基因。DRMs亚家族中成员最丰富，包含4个辣椒DRM基因。在同科的马铃薯和番茄中，几乎都能找到辣椒DNA甲基化修饰相关酶基因对应的同源基因。

辣椒甲基化修饰酶基因在不同组织的时空表达模式分析

利用辣椒不同组织（包括根、茎、叶、花蕾、花、不同发育时期的果实）RNA-Seq数据库中辣椒DNA甲基化修饰酶基因对应转录本的FPKM值，绘制基因表达热图（图5）。结果显示，和在辣椒所有组织的表达量均很低，特别是，几乎在辣椒所有组织中均不表达;而和在所有组织中表达量均较高，特别是，在根、茎和叶中的表达量均是最高的。在花蕾中，和表达量最高，而在开放的花中，、和表达量居前三。

本研究详细分析了相关基因在辣椒果实发育与成熟过程中的表达情况。结果显示，除几乎不表达外，其他基因呈现不同的表达模式。在果实膨大过程中（F-Dev1～F-Dev5），和表达量一直较高，随着果实的发育，、CaMET1-like和的表达量逐步升高，在绿熟期前后达到最大值;与之相反，随着果实的发育，、和的表达量逐步降低，在绿熟期前后达到最小值。在果实成熟（变色转红，F-Dev5～F- Dev9）过程中，、、和均表现出逐步下调的趋势，在完全成熟的果实中表达量达到最低值。

辣椒甲基化修饰酶基因在高温胁迫下的时空表达模式分析

对高温胁迫处理下基因的表达模式进行qPCR验证（图6），结果显示，在高温胁迫处理后，基因表达呈现不同的变化趋势。其中，和受高温胁迫表达量显著降低，分别在3 h和6 h达到显著差异。有9个基因呈现先上升后降低再上升的规律。处理后3 h，除外，另外8个基因相比于其他时期表达量最突出。其中表达量变化最显著的是与对照相比其表达量上调8倍，变化量最不明显的是，上调不到1倍。和在处理12 h后，表达量出现峰值，分别上调11倍和25倍。DNA甲基化修饰酶基因的表达量随高温胁迫呈现不同的变化趋势，推测这些基因在辣椒响应高温胁迫过程中具有一定的调控作用。

辣椒甲基化修饰酶基因在盐胁迫下的时空表达模式分析

对盐胁迫下的13个基因进行qPCR验证，结果见图7。13个基因在盐胁迫后12 h内的表达量发生显著变化。和受盐胁迫诱导表达，呈现逐步升高的趋势，在12 h表达量达到最高，其中表达量差异变化最大的是，与对照相比上调9倍，变化最小的，与对照相比上调1.5倍。与之相反，、和在盐胁迫处理后，表达量显著降低。和呈现先抑制表达后诱导表达的趋势。辣椒DNA甲基化修饰酶基因在盐胁迫下呈现不同的表达模式，推测这些基因参与辣椒盐胁迫响应诱导的机制可能不同。

讨论

DNA甲基化是由甲基化修饰酶基因催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）上的甲基与基因组DNA上的胞嘧啶第5位碳原子进行共价结合，将其修饰为5-甲基胞嘧啶（5-mC）的过程。DNA甲基化修饰酶（包括DNA甲基转移酶和DNA去甲基化酶）在调控甲基化与否和甲基化水平高低中起着非常重要的作用。DNA甲基化修饰酶家族的全基因组学鉴定已在拟南芥、水稻、玉米和番茄等多种植物中有过报道，部分基因如、在模式植物擬南芥和水稻中的功能也有一些深入研究。然而关于辣椒DNA甲基化修饰酶基因的研究还鲜见报道。因此，本研究基于已测序的辣椒基因组数据库鉴定出DNA甲基转移酶和DNA去甲基化酶基因家族成员，并通过全面的生物信息学分析和表达分析，为辣椒甲基化修饰酶基因的功能挖掘提供参考依据。

辣椒基因组中共包含10个DNA甲基转移酶基因和4个DNA去甲基化酶基因，与同科的番茄、马铃薯中报道的基因数量一致，比花生基因组中报道的少，这一差异的发生可能因为不同物种间基因组大小和复制方式存在差异。一般来说，在系统进化树上聚集在同一亚族的基因可能具有类似的功能。本研究对拟南芥、番茄、马铃薯和辣椒的甲基化修饰酶基因进行系统进化关系分析，辣椒DNA甲基化修饰酶基因家族可分为a、b、c和d四个亚家族，分别为DRMs、DNMT2、MET1和CMT3，分类结果与前人在拟南芥中的报道一致。说明辣椒DNA甲基化转移酶基因家族进化相对保守。

基因的组织特性表达特征一定程度上与基因的功能密切相关。已有研究结果表明，DNA甲基化修饰酶基因在植物不同组织和不同发育时期的果实表现出特异性表达。如柑橘在幼苗和嫩叶中偏好表达，番茄中的在幼嫩组织中表达量高。番茄中4个DNA去甲基化酶基因（～），在所有组织中的表达量极低，和在叶片、

花和幼果中表达量高，并均随器官发育成熟，表达量降低;随果实发育与成熟，从转色期开始的表达量极显著升高，在橙色果实中表达量最高。本研究发现，在辣椒茎和根组织中的相对表达量最高，和在辣椒花蕾组织中相对表达量高于其他基因，推测其在花蕾发育中发挥促进作用。辣椒果实发育过程中，随着果实的发育，、和的表达量逐步升高，在绿熟期前后达到最大值，反方，随着果实的发育，、和的表达量逐步降低，在绿熟期前后达到最小值，推测他们参与了辣椒果实发育与成熟过程的调控。另外，对柑橘果实发育与成熟过程的甲基化组学分析表明，柑橘果实发育与成熟过程伴随DNA甲基化水平的升高，DNA去甲基化酶基因表达量降低，最终激活ABA信号基因的表达触发了柑橘果实的成熟。今后也可对辣椒果实发育过程中的甲基化组进行分析，有利于更深入地解析DNA甲基化在辣椒果实发育中的调控作用。

当植物遭受非生物胁迫时，其体内的DNA甲基化会迅速发生动态变化，从而调控相关胁迫应答基因的表达，实现植物对非生物胁迫的快速响应。而DNA甲基化修饰酶基因也会响应胁迫应答，基因的表达量发生变化。如玉米中的、、和在干旱和盐胁迫下表达量显著下调，而、、和的表达不受干旱和盐胁迫诱导。在低温胁迫下，番茄和的表达明显受到抑制;而在盐胁迫下，的表达量显著升高，在4 h达到峰值，在12 h后表达量增加了13倍，而和的表达几乎不受盐胁迫影响。茶树中6个DNA甲基转移酶基因，包括、、、、和在冷胁迫下均显著下调，干旱胁迫下，、、和在12 h表达量显著降低，而、和等基因显著上调表达。石斛基因组中DNA甲基转移酶和DNA去甲基化酶基因的表达也受冷胁迫和干旱胁迫诱导或抑制，呈现不同的表达特性。本研究分析了辣椒DNA甲基化修饰酶基因在高温（42℃处理）和盐（200 mmol/L NaCl）胁迫下基因的表达情况，发现和受高温胁迫表达量显著降低，同时、和等表达量显著上调，研究结果与在茶树中的研究一致。在盐胁迫下，有的基因如和的表达量逐步升高，有的基因如、和的表达量显著降低。也有一些基因如和呈現先抑制表达后诱导表达的趋势。辣椒DNA甲基化修饰酶基因在盐胁迫下呈现不同的表达模式，推测这些基因参与辣椒盐胁迫响应诱导的机制可能不同。本研究结果为进一步揭示辣椒甲基化修饰酶基因的功能提供了参考依据。

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