基于IKnife-REIMS技术对地理标志保护产品习水麻羊产地溯源的研究

张 季，凌 蕾，卢 叶，杨 沙，王兰兰，向丽萍,

（1.遵义市产品质量检验检测院，贵州遵义 563099；2.国家茶及茶制品质量监督检验中心，贵州遵义 563099）

习水麻羊，属全国地方良种，贵州省遵义市习水县为原产地，现已经成为中国国家地理标志产品[1]。它是我国一个重要的动物遗传基因资源，2009年经国家畜禽遗传资源委员会专家现场鉴定为国家级畜禽遗传资源，2011年入选《中国畜禽遗传资源志·羊志》[2]。

目前已经发布了遵义市地方标准DB5203/T 29-2019《地理标志产品习水麻羊》[3]，其中规定了贵州省遵义市习水县现辖行政区域，品种为黔北麻羊。为了做大做强肉羊产业，当地政府和企业结合习水麻羊优良的品质资源，开发特色羊产品，树立品牌，满足市场和消费者的需求[4]。但是，目前市场上随处可见其它产地或品种的羊肉以次充好，假冒正宗的习水麻羊，给政府监管、消费者和市场带来了许多负面影响[5]。所以如何在习水麻羊养殖、加工、运输、销售的关键环节快速地对其进行产地溯源，成为当前迫切需要解决的一个难题。

目前，关于习水麻羊的产地溯源工作鲜有研究，其它不同样品的此类研究方法繁多，例如蛋白检测技术[6-7]、光谱检测技术[8-10]、基因检测技术[11-15]、同位素检测技术[16-18]和质谱检测技术[19-21]等。除此以外，例如分析各产地藏猪肉中的常见常量元素、微量元素及重金属元素在含量上的差异作为产地溯源的有效指标提供参考[22]。上述相关溯源方法需要对样品进行复杂的前处理，耗时较长，不能够实现快速高效、实时溯源和样品量大的检测需求。

2009年，ZoltanTakats教授等通过将高频的手术刀与质谱相连创建了电子手术刀（Iknife），使生物组织快速蒸发，产生大量组织源性信息的气体分子进入质谱检测。该项技术被命名为快速蒸发电离技术（REIMS），它是一种新兴的原位电离技术，可以快速电离蒸发生物组织而无需样品的制备。REIMS技术被应用于食品研究领域，例如使用Iknife手术刀-快速蒸发电离质谱法在8～12 s内获取数据，用于鱼肉造假的实时代谢组学分析方法[23]。区分生马肉和生牛肉、烹饪好的马肉和烹饪好的牛肉，只要马肉的含量＞5%，REIMS也能实现很好的区分[24]，通过REIMS在10 s内就可以很好的通过模型的构建区分母猪肉、公猪肉以及因为没有阉割，而带有膻味的公猪肉。这比传统的鉴别方式速度快很多[25]，IKnife-REIMS联用技术检测对南极犬牙鱼进行样品采集，通过响应面分析优化法对脂质组学轮廓进行分析等[26]。

本研究基于飞行时间质谱仪，通过IKnife-REIMS对习水麻羊和其它产地羊肉新鲜样品进行原位电离分析，建立起了习水麻羊和其它产地羊肉的数据模型，使得习水麻羊能够进行实时溯源，并通过软件和数据库鉴别出习水麻羊和其它产地羊肉的特征标记物，为习水麻羊有效监管和产品产地追溯提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇 质谱纯，德国默克公司；亮氨酸脑啡肽（Leu-Enkaphalin） 美国沃特世公司；冷冻饺子盒食品级PP材质，有密封盖，尺寸为31 cm×23.5 cm×3.5 cm，每格尺寸为7 cm×3.5 cm，九阳厨具；本研究共收集可靠的62组羊肉样品，样品均由专人收集，确保产地准确真实。供试样品明细见表1。

表1 样品信息表Table 1 Sample information sheet

原位电离源飞行时间质谱仪（Xevo G2-XS REMIS Q-TOF） 美国Waters公司；高频电子刀 德国爱博（erbe）公司产品；XY-201烟雾净化器 深圳市星奕环保科技有限公司；Milli-Q Reference超纯水发生器 美国Millipore公司；IKnife-REIMS采集羊肉样品装置图见图1。

图1 REIMS采集羊肉样品装置图Fig.1 Device for collecting mutton use REIMS

1.2 实验方法

1.2.1 样品数据采集 羊肉样品的切割长约（10 cm）、宽约（4 cm）、高约（8 mm）的片状物，放置于冷冻饺子盒中保存，需要使用时置于冷藏室解冻，整齐地平铺放置于锡箔纸上，采用erbe高频电刀对样品进行数据切割采集。切割电压选取了10～50 V，长度选取0.5～3 cm，深度选取0.2～1.0 cm，时间选取1～5 s，每份样品重复采集10～15刀。

每测试约10～15份样品或者发现基线噪音过大时，需清洗离子源、手术刀和连接管路，使采集样品的数据准确可靠。

1.2.2 检测条件 原位电离源飞行时间质谱仪采用Leu-Enkaphalin亮氨酸脑啡肽（m/z=554.2615）作为质量数校正内标，以甲醇为辅助溶液，流速200 μL/min，电加热探针温度500 ℃，质量数扫描范围50～1200 m/z，扫描时间1.0 s，根据文献和初步实验，脂肪酸和磷脂在负离子模式下比正离子模式更容易产生电离[27-28]，故本实验采用负离子模式采集样品。

1.3 数据处理

首先应用LiveID软件根据实际情况选取TIC阈值，根据羊肉的产地建立不同的4组分组，将不同产地羊肉采集数据上传至各个分组，分别是习水麻羊、贵州羊、吉林羊和内蒙古羊，采用参数：主成分为25个化合物，线性判别为3，未识别阈值为20%，建立主成分分析（PCA）结合线性判别分析（LDA）的模型，观察不同分组下不同产地羊肉的聚类分析情况。

应用Progenesis Bridge软件对REIMS原始数据进行分割，导入Progenesis QI软件进行峰提取和差异化分析，考察样品的聚类情况。通过EZinfo软件找寻VIP＞1的差异化合物，进一步筛选并通过数据库对其进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 采集条件的优化结果

新鲜羊肉样品的脂质较多部分（表皮、皮下脂肪等）切割的信号响应较低，且与所需实验数据相差较大，所以均只采集瘦肉组织部分。为了保证采集数据稳定且有效，总离子流图中各个数据峰强度应不低于5×107，故通过对不同参数条件的反复测试，最终确定电压设定为40 V，长度2 cm，切口深度0.5 cm，切割持续时间2～3 s为最优采集条件。选取习水麻羊的里脊肉切割得到负离子模式下总离子流图和质谱图示于图2。

图2 习水麻羊样品在负模式下的总离子流图和质谱图Fig.2 Total ion count chromatogram and mass spectrum of Xishui brown goat at negative model samples

2.2 聚类分析结果

多元统计分析被应用于鉴别习水麻羊。通过Live ID软件建立4组分组，分别是习水麻羊、内蒙古羊、吉林羊和贵州羊（除习水），选择主成分分析（PCA）和选取25个主成分的线性判别分析（LDA）模式建立模型图，见图3。由图3可见，有一些重叠的点位于不同的两组样品之间，但是4组分组总体上都有着良好的聚类分离效果，能区别于其它分组。创建该模型是用于预测实时在线分析的结果。输出验证报告包括了所有分组的数量和能识别的、未识别的数量。

图3 不同羊肉REMIS数据PCA-LDA聚类分析三维图Fig.3 Three-dimensional graph of PCA-LDA cluster analysis in the REMIS data of different mutton

2.3 识别模型验证

在Live ID软件中对对习水麻羊、内蒙古羊、吉林羊和贵州羊的62个样品共709个数据进行总体交叉模型组间验证分析，随机分为5组，任意挑选4组建立新的模型，该模型对剩余的1组数据进行验证，重复5次，预测模型的测定精确度。识别率为97.32%，结果列于表2和图4。

表2 模型交叉验证结果Table 2 Results of cross validation in model

由于该模型的建立最终是为了鉴别生产环节、流通领域中习水麻羊的产地溯源，故实验人员在市场上随机选取了正宗的习水麻羊样品（未加入建立模型），通过Iknife-REIMS系统重复切割该样品获取数据，通过上述模型对其进行实时验证分析，分析结果全部匹配为习水麻羊，见图4；说明REIMS检测技术结合Live ID软件所建立的实时溯源分析模型对习水麻羊的产地溯源检测初步确定为准确可靠。

图4 习水麻羊实时验证结果Fig.4 Real-time identification of Xishui Brown Goat sample

2.4 特征标记物的筛选与鉴别

除了使用REIMS快速对习水麻羊进行产地溯源外，找寻特征差异化合物对于习水麻羊产地溯源工作也至关重要。通过EZinfo软件对习水麻羊与其它羊（内蒙古羊、吉林羊和贵州羊的总和）进行OPLSDA模型分析，见图5；选取变量权重值（VIP）＞1、方差分析非参数检验P值≤0.05条件下的标记化合物，得到习水麻羊和其它羊差异分析Loadings图，见图6。

图5 习水麻羊和其它羊鉴定成分得分图Fig.5 Score plot of the identified compositions of XishuiBrown Goat and other sheep

图6 习水麻羊和其它羊差异分析Loadings图Fig.6 Loadings differential analysis for Xishui Brown Goat and other sheep

将Loadings图中主要差异化合物运用Progenesis QI软件生成的丰度图，例如质荷比m/z为282.2512的化合物在习水麻羊和其它羊之间的丰度如图7。

图7 质荷比为282.2512化合物的丰度图Fig.7 Abundance diagram of the compound with a mass-to-charge ratio of 282.2512

将该质荷比信息通过LIPID MAPS数据库中搜索鉴别得到可能的化合物信息如表3，可能的结构式信息如图8。

图8 质荷比为282.2512化合物的可能的结构式Fig.8 Possible structural formula of the compound with a mass-to-charge ratio of 282.2512

表3 质荷比为282.2512化合物的可能的化合物信息Table 3 Possible compound information of the compound with a mass-to-charge ratio of 282.2512

同样的方式通过LIPID MAPS数据库将剩余的化合物进行匹配识别，按最大倍数变化（Max fold change）由大到小排序，选取变化大的标记物通过LIPID MAPS®Lipidomics Gateway网站进行信息匹配，共计筛选出16个差异较大的特征标记物，见表4。

表4 习水麻羊和其它羊的特征标记化合物Table 4 Characteristic marker compounds between Xishui brown goat and other sheep

表4显示了习水麻羊和其它羊通过REIMS切割得到的质荷比（m/z）在50～1200范围内的特征标记化合物，总共有16个化合物作为两者之间的差异较大化合物。REIMS作为一个相对高能量的过程，分别诱导磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的去甲基化（[M-CH3]-）和脱氨基（[M-NH3]-）。例如质荷比（m/z）为282.2512和280.2402的离子峰可能产生于羧酸根阴离子分别为[R18:2COO]-和[R18:1COO]-的游离脂肪酸（m/z=721.5258的离子峰）。其它羊的特征标记物主要集中在质荷比（m/z）大于700的磷脂一类化合物，其中，鞘氨醇（m/z=721.5258）和磷脂酰肌醇（m/z=866.5884）为主要离子峰；习水麻羊的特征标记物主要集中在质荷比（m/z）＜430的小分子脂肪酸一类化合物，其中，十七碳二烯酸（m/z=280.2402）和二十碳二烯酸（m/z=304.2402）为主要离子峰。习水麻羊中琥珀酸作为特征标记化合物区别于其它羊，可能是由于贵州良好的山地自然资源与习水麻羊放牧式喂养，促使习水麻羊食用天然含有琥珀酸的植物，因为琥珀酸属于短链脂肪酸（碳原子＜6），天然来源是松属植物的树脂久埋于地下而成的琥珀或多种植物组织中。通常飞行时间质谱仪用于定性分析，定量分析不及三重四级杆质谱，鉴定出的化合物需要进一步通过购置相关标准物质使用三重四级杆用于定量分析，得到准确结果，这样不仅能找出习水麻羊和其它产地羊之间的差异化合物，还能够分析它们的含量高低，为进一步研究习水麻羊中的内含成分提供理论支撑。

3 讨论与结论

本研究依托原位电离源-飞行时间质谱仪和Live ID等软件，建立了一种对习水麻羊产地溯源的实时检测方法，该方法不需要对羊肉样品进行复杂的前处理工作，通过前期数据采集建立模型就能对未知羊肉样品进行实时产地溯源工作，且分析时间缩短至数秒，不过该技术需要收集大量的真实样品用于建模，所以将来会不断采集不同年龄、不同部位、不同养殖场的习水麻羊来完善该模型。

另外，通过Progenesis QI、EZinfo等软件对羊肉样品数据进行统计学分析，筛选并鉴定一系列特征标记物，这为将来利用特征标记物进一步鉴别习水麻羊提供前期理论基础，同时，筛选特征且有益的化合物对于习水麻羊的产品力竞争、销售也有着积极的推广作用。