circRNA_0085135在胃癌患者血清中的表达及意义*

彭晴，邱陈玲，贡继尧，郑培明，李世宝，徐银海

( 1.徐州医科大学医学技术学院，江苏徐州 221000；2．徐州医科大学附属医院检验科，江苏徐州 221000；3.河南省人民医院检验科，郑州 463599)

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。胃癌发病隐匿，早期不易察觉，确诊时往往已是晚期，而晚期胃癌患者的5年生存率不足25%[1]。目前胃镜检查与病理活检仍是诊断胃癌的主要方法，但由于其侵入性，患者耐受性较差[2]。传统肿瘤标志物如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、糖类抗原19-9(carbohydrate antigen19-9，CA19-9)、糖类抗原72-4(carbohydrate antigen72-4，CA72-4)等在胃癌的临床诊断中均存在敏感性或特异性较低等缺陷。因此，寻找一种理想的肿瘤标志物用于胃癌诊断、监测预后以及寻找药物治疗的靶点具有重要的临床意义。近年来，越来越多证据表明,胃癌中存在大量差异表达的circRNA，其广泛参与胃癌发生、发展过程[3]。本课题组前期研究[4]通过基因芯片技术发现，circRNA_0085135在胃癌细胞系(MKN-45、MGC-803和HGC-27)中的表达量均显著高于正常胃上皮细胞系。本研究拟运用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测胃癌患者血清circRNA_0085135的表达水平，分析其与胃癌患者临床病理参数的关系，评估其对胃癌的临床诊断效能。

1 资料与方法

1.1临床资料 收集2022年1月至10月于徐州医科大学附属医院普外科就诊的62例胃癌患者的血清样本，其中男性50例，女性12例，年龄(64.9±11.7)岁，纳入标准：(1)均经病理组织活检证实为原发性胃癌；(2)未经手术、放疗、化疗等治疗；(3)临床病理资料完整。排除标准：(1)合并有其他部位肿瘤；(2)患有严重精神疾病者；(3)患有严重心、肺、肾、神经系统等疾病。临床分期: 按国际抗癌联盟(UICC)第8版指南[5]和国家综合癌症网络(NCCN)肿瘤学临床实践指南标准分期[6]分为T1/T2期27例，T3 /T4 期 35例;肿瘤大小:≥5 cm 38例，<5 cm 24例;存在淋巴结转移 31例，无淋巴结转移31例;存在神经侵犯 17例，无神经侵犯 45 例;分化程度:高分化 7例，中、低分化 55例;肿瘤标志物(CEA、CA19-9、CA125、CA72-4) 升高:是18例，否44例。收集同期于消化内科就诊的胃部良性疾病(主要为慢性胃炎)患者血清样本50例，其中男性18例，女性32例，年龄 (56.8±13.2)岁，患者均经内镜检查及临床确诊；另外收集体检中心体检健康者血清标本50例，其中男性25例，女性25例，年龄 (50.9±8.8)岁。本研究经徐州医科大学附属医院伦理委员会批准(批准文号：XYFY2022-KL368-01)，各研究对象均知情同意。

1.2主要仪器及试剂 Trizol试剂(美国ABI公司)，逆转录试剂盒、PCR试剂盒(武汉赛维尔生物科技公司)。Mastercycler nexus gradient梯度PCR仪(德国Eppendorf公司)，LightCycler96实时荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)，OneDropTMOD-1000+超微量分光光度计(南京五义科技公司)。

1.3标本采集 使用含有分离胶的促凝采血管采集各研究对象治疗前(体检者于体检时采集)的空腹静脉血5 mL，4 ℃、4 000 r/min离心10 min，吸取上层血清，转移至无核酶的EP管中，样本置于-80 ℃保存。

1.4RNA提取及逆转录反应 按照Trizol试剂说明书提取血清总RNA，并用紫外分光光度计检测所提取RNA的纯度，选取吸光度(A260 nm/A280 nm)在1.8～2.0的样本用于后续试验。按照逆转录试剂盒说书操作将RNA逆转录为cDNA，标本置于-20 ℃保存。

1.5引物设计及实时荧光定量PCR(RT-qPCR) 根据circBase数据库(http://www.circbase.org)登录的circRNA_0085135和内参GAPDH基因的序列号(分别为NM_002568和NM_002046)，用Oligo7引物设计软件设计引物，并由武汉赛维尔生物科技公司合成。circRNA_0085135上游引物序列:5′-TACAAGCCCACCAAGCTAAAGA-3′,下游引物序列:5′-ATGACTCGTGGAACCTGTGAAG-3′，退火温度为59.7 ℃，产物片段大小为166 bp。GAPDH基因上游引物序列:5′-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3′，下游引物序列:5′-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3′，退火温度为62.4 ℃，产物片段大小为168 bp。PCR总反应体系为20 μL，包括:2×SYBR Green Mix 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8.2 μL。循环参数：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，45个循环；用仪器配套的LightCycler®96分析软件于72～95 ℃时收集荧光信号，并分析数据。每个样本设置3个复孔， circRNA_0085135的相对表达水平以2-ΔΔCt法计算。公式:ΔΔCt=[(实验组Ct目的基因-实验组Ct内参基因)-(对照组Ct目的基因-对照组Ct内参基因)]。每组设3个复孔，重复3次。

1.6统计学分析 采用GraphPadPrism 8.0与SPSS 24.0软件进行统计学分析和绘图。偏态分布的计量资料以M(P25,P75)表示，多组间比较采用独立样本的非参数检验(kruskal-wallisH检验)，组间两两比较采用dunn检验。计量资料以例数(n)和率(%)表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。以体检健康者和胃部良性疾病患者作为对照组，胃癌患者为疾病组，绘制ROC曲线并评估血清circRNA_0085135在胃癌中的临床诊断价值。

2 结果

2.1circRNA_0085135在各组中的表达水平 血清circRNA_0085135在胃癌组中的相对表达量为24.96(10.51,41.45)，显著高于胃部良性疾病组的6.13(0.23,17.82)和健康人对照组的0.79(0.18，5.83),差异有统计学意义(H=61.79，P<0.000 1)。 采用Bonferroni法校正显著性水平后进行组间两两比较发现，胃癌组和胃部良性疾病组(χ2=40.792，P<0.000 1)，胃癌组和健康人对照组(χ2=69.212，P<0.000 1)，胃部良性疾病组和健康人对照组(χ2=28.420，P=0.007)之间的差异均有统计学意义。

2.2血清cirRNA_0085135的表达与胃癌患者临床病理参数的关系 以胃癌患者血清circRNA_008135相对表达量的中位数(24.96)为分界点，将胃癌患者组其分为高表达组 (31例) 和低表达组(31例)，分析血清circRNA_0085135与胃癌患者临床病理参数之间的关系。结果显示，高表达组与低表达组的TNM分期、肿瘤最大径、淋巴结转移之间的差异有统计学意义(P<0.05)。但年龄、性别、神经侵犯、分化程度、肿瘤标志物升高之间的差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 血清circRNA_0085135的表达与胃癌临床病理参数的关系[n(%)]

2.3血清circRNA_0085135诊断胃癌的临床效能 血清circRNA_0085135诊断胃癌的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.812 6(95%CI：0.745 8～0.879 4，P<0.000 1)，当cut-off值为6.390时，敏感性为87.1%，特异性为64.0%，见图1。

图1 血清circRNA_0085135用于胃癌诊断的ROC曲线

3 讨论

本研究通过RT-qPCR检测证实，血清circRNA_0085135在胃癌患者血清标本中的表达水平与胃部良性疾病组和健康人对照组之间均存在显著差异，提示其可能作为致癌基因在胃癌的进展过程中发挥一定的作用。此外，笔者通过分析血清circRNA_0085135的表达与胃癌患者临床病理参数之间的关系，结果发现血清circRNA_0085135水平与胃癌患者TNM分期、肿瘤最大径、淋巴结转移显著相关(P<0.05)。在诊断效能方面，Yu等[7]研究表明，与癌旁组织相比，胃癌组织中 hsa_circ_0067582的表达水平明显降低， hsa_circ_0067582诊断胃癌的AUCROC为0.6937，敏感性为66.67%，特异性为61.29%。而本次实验以胃部良性疾病+体检健康者为对照组，以胃癌为疾病组，结果发现其敏感性为87.1%，特异性为64.0%，表明circRNA_0085135有望作为胃癌潜在的诊断标志物。

本研究仍有一些不足之处。首先，本研究收集的样本数量有限，需要收集更多的样本以评价血清circRNA_0085135的诊断效能。其次，在分析血清circRNA_0085135与胃癌患者临床病理参数时，收集的临床数据不完善，且由于收集的为2022年就诊患者的血清样本，无法获得足够的预后资料及随访信息，今后需收集更详细、更全面的数据用于分析。后续笔者将增加样本量，同时收集患者随访资料，进行预后及生存资料分析，并通过生物信息学预测并验证circRNA_0085135潜在的靶基因以及可能参与的信号通路，同时进行体外和体内实验以探究其在胃癌中的发病机制。