奶牛副结核病的诊断方法研究

柴贵明

内蒙古自治区巴彦淖尔市乌拉特中旗动物疫病预防控制中心，内蒙古巴彦淖尔 015300

0 引言

副结核病是一种进行性慢性传染性肉芽肿性肠炎，主要危害牛羊生产，可造成患病动物肠道、肝脏淋巴结等器官损伤，导致病畜腹泻、进行性消瘦，从而给牛羊养殖业造成严重的经济损失[1]。副结核病于1895年被首次报道，1906年成功构建人工感染模型并命名为约内病[2]。我国于1953年首次报道该病，1972年后多个省市的牛场陆续发现该病[3]。副结核病主要导致肠道炎症和功能障碍，病理变化通常出现于空肠和回肠，病变为肠壁增厚和水肿，肠系淋巴结肿大水肿，有时肝脏和肝脏淋巴结也可出现病变。肠道病变可影响营养物质的吸收，从而导致病畜出现腹泻、下颌水肿、体重降低、营养不良、消瘦，严重时可造成病畜死亡[4]。相比于其他动物，副结核病对奶牛养殖业造成的影响更大，可导致牛死淘率增加、产奶量下降、饲料转化效率降低、繁殖能力降低、屠宰价值降低以及增加对其他疾病的易感性。本文将重点对副结核对奶牛产业造成的经济危害以及诊断方法进行综述。

1 流行病学

副结核病的病原为禽分枝杆菌副结核亚种，又名副结核杆菌，主要感染牛、绵羊和山羊，也可感染马、鹿、羊驼、骆驼、驼鹿、麋鹿、驯鹿、猪、兔、白鼬、獾、狐等动物。有流行病学数据显示，家养反刍动物可通过接触感染副结核杆菌的野生动物从而感染，并且野生动物可能是家畜感染副结核病的重要传染源[5]。在奶牛场中，副结核杆菌主要通过患病或感染牛的粪便和牛奶经口传播，回肠和空肠是该菌主要定殖的部位。此外，子宫内传播和气溶胶传播也是该病的重要传播途径。奶牛副结核病的潜伏期较长，表现出临床症状时间主要于2～6岁，部分感染牛虽然不表现临床症状，但可通过粪便、乳汁和精液等向牛群中持续排出副结核杆菌，从而导致牛群感染率增加。

2 发病机制

副结核杆菌主要通过口腔进入宿主体内，经消化系统到达回肠上皮细胞，随后进入M细胞后被巨噬细胞吞噬，副结核杆菌可在巨噬细胞内长期存在并逃避宿主的免疫反应，进而在宿主的小肠内隐性感染[6]。副结核杆菌可通过多种途径在巨噬细胞内潜伏感染，包括：抑制吞噬体酸化和吞噬溶酶体融合，增强巨噬细胞分泌IL-10，降低巨噬细胞清除胞内病原体的能力[7]。在黏膜下层定殖的副结核杆菌会吸引更多的巨噬细胞、巨细胞和淋巴细胞到细菌定殖区从而造成肉芽肿性炎症，破坏肠道组织结构，影响其正常功能[8]。随着副结核杆菌数量逐渐增多，细胞介导的免疫反应减弱，病原菌进一步在宿主组织内传播，并开始通过粪便脱落，引起宿主体液免疫反应。目前对于副结核杆菌感染的免疫反应的转变过程和疾病发展之间的关系尚不明确，但随着免疫反应的转变，宿主也逐渐出现临床症状。宿主开始通过粪便排出副结核杆菌到出现临床症状之间的时间是不固定的，有些动物感染后可在6 个月内出现明显的症状，但是部分动物可通过粪便排出副结核杆菌数年而不表现临床症状[9]。副结核杆菌感染引起的小肠进行性肉芽肿性炎症会造成肠道吸收功能障碍，从而导致病牛出现腹泻症状，体重减轻，甚至可出现脱水症状。大多数患病动物的病变仅局限于远端小肠，不会延伸至回盲瓣，肠黏膜增厚、起皱、变红，肠系膜淋巴结肿大、苍白。病变部位的组织病理学特征为肉芽肿性炎症，肠绒毛固有层和黏膜下层的巨细胞和巨噬细胞数量增多。

3 对奶牛的危害

副结核病对奶牛个体的健康和福利的影响是直接的，除导致腹泻、消瘦等明显的临床症状外，还可损害奶牛的免疫系统，导致病牛对其他病原体易感性的增加。有研究表明，奶牛的副结核病与继发性肺炎之间有着显著的相关性[10]。

副结核病对奶牛养殖可造成严重的经济影响。有研究表明，在美国、加拿大和澳大利亚的奶牛场，因副结核病造成的经济损失分别为每头牛每年100 美元、49 美元和44 美元[11]；奶牛产奶量减少500～1400 kg/头[12]。副结核病还会导致奶牛肠道炎症和功能障碍、吸收不良综合征和蛋白质丢失性肠病，从而对饲料转化率和体重增加产生负面影响。由于副结核病导致的过早淘汰和死亡会导致直接性的经济损失。

副结核病还可能还与人类的克罗恩病相关[13]。牛奶中的副结核杆菌经巴氏消毒后还能存活，这使得感染副结核菌的奶牛生产的牛奶成为潜在的传染源，危害牛奶及相关制品的食品安全。

4 诊断

4.1 诊断方法

奶牛的副结核病的检测方法可分为直接检测副结核杆菌的直接检测方法和检测宿主对副结核杆菌感染引起的特异性免疫反应的间接方法。

4.1.1 直接检测方法

（1）组织病理学检测

根据病牛剖检结果是否存在肠道增厚、肠道内壁变红和起皱等病理变化的观察，回肠、空肠、回盲瓣膜和肠系膜淋巴结是最主要的检测部位。该方法是诊断奶牛副结核病的参考诊断方法，但部分奶牛剖检后病变不明显，因此主要用于辅助诊断。

（2）粪便细菌培养

粪便样品的细菌分离鉴定是诊断该病的重要检测方法之一，常用的培养基有固体培养基（如Herrold蛋黄培养基）和液体培养基（如M7H9C）。

（3）粪便PCR

粪便PCR检测是当前检测奶牛副结核病的主要检测方法之一，是通过PCR或荧光PCR特异性扩增副结核杆菌高度保守的特异性基因，该方法能快速、准确地诊断出粪便样品中是否存在副结核杆菌。但是粪便样品含有的微生物数量较多，DNA提取难度较大，是影响该方法检测效果的重要因素之一。

（4）噬菌体检测

使用噬菌体检测来检测活的副结核杆菌是一种相对较新的技术，但该方法的检测效果仍需进一步评估。噬菌体检测方法主要使用的是D29分枝杆菌噬菌体，该噬菌体可靶向一系列分枝杆菌[14]。为了使噬菌体检测方法对副结核杆菌具有更高特异性，在大多数已发表的方法中都应用了额外的PCR步骤，但仍需进一步评估和验证噬菌体检测方法对粪便和牛奶样品的检测效果，以确定该方法作为副结核杆菌新诊断检测方法的适用性。

4.1.2 间接检测方法

（1）ELISA

最常见的副结核杆菌间接检测方法为间接ELISA，该方法可对血清或牛奶样品中的抗副结核杆菌的特异性抗体进行检测，以评估奶牛的感染情况。使用ELISA检测牛奶样本，进而评估牛奶质量和诊断奶牛感染，是一种高效的检测方法。

（2）γ-干扰素检测

γ-干扰素检测 （IFN-ƴ）是使用 ELISA 检测血液中的IFN-ƴ，该方法可以比 ELISA 抗体检测更早地检测到副结核杆菌感染，因为该方法可以检测到副结核杆菌感染初期的细胞免疫反应，此阶段奶牛未出现特异性的体液免疫。

4.2 群体感染水平检测

由于奶牛场奶牛养殖数量较多，并且副结核杆菌感染奶牛后的潜伏期较长，因此当个体发病时副结核杆菌已在群体内传播了较长的时间。为了准确评估牛群整体感染情况以及降低检测成本和工作，经常需要进行奶牛群体感染水平的检测。常用的检测方法有全群血清学检测、散装奶罐样品检测、粪便汇集检测以及环境样品检测，在奶牛场副结核杆菌的净化和监测工作中，上述群体检测方法常与个体检测方法同时进行，用于评估牛群中奶牛的感染情况。

5 结语

奶牛副结核病是一种慢性疾病，在感染后期病牛才会逐渐显示出症状，因此该病无特效治疗药物，需要采取定期监测净化和有效的生物安全管理措施进行科学的预防。副结核杆菌感染后具有较长的潜伏期，准确灵敏的检测方法在诊断奶牛副结核病方面具有重要的作用。当前，奶牛副结核病的诊断方法已基本满足诊断需求，但仍存在检测周期长、成本高、特异性和灵敏度不稳定等问题，未来仍需研发更适合兽医临床使用的低成本、准确和快速的检测方法以提高奶牛副结核病的诊断效率和准确性。