土壤水分和植株密度互作对紫花苜蓿植株性状和叶片特征的影响

陈文瑞，蒋 朝，唐 娜，吴征江，武文莉，戴洪伟，李春鸣，刘慧霞

（西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃 兰州 730030）

紫花苜蓿(Medicago sativa)营养价值高、抗逆性强[1]，被广泛应用于我国北方干旱半干旱地区栽培草地的建植[2]，现已形成以甘肃河西走廊、宁夏河套灌区和内蒙古科尔沁草地等一批十万亩以上集中连片的优质苜蓿种植基地[3-4]，不仅为我国北方地区现代畜牧业的发展提供大量优质牧草[1]，而且为防风固沙和改良土壤提供了助力[5-6]。灌溉是这一地区紫花苜蓿稳定高产的重要保证，适宜的土壤含水量既能保证紫花苜蓿稳定高产，又能提高紫花苜蓿的水分利用效率。适宜植物的生长，提高水分利用效率的土壤水分含量与其种植密度紧密相关，密度过大会增加植物蒸腾量和建植成本[7-8]，过小则会增加地表蒸发，降低灌溉水分利用效率[9]。因此，只有紫花苜蓿植株密度和土壤含水量处于最佳耦合状态时，紫花苜蓿栽培草地才能实现稳定高产，高效利用灌溉水效率。

紫花苜蓿植株性状的可塑性，是其适应土壤含水量变化和种内竞争的重要策略[10]，可用于评价紫花苜蓿个体及种群应对环境变化的状况[11]，而叶片是应答土壤含水量变化和种内竞争关系变化的最敏感器官[12-13]，主要是叶片决定着紫花苜蓿的光合速率和蒸腾速率[14-15]。植株性状和叶片特征经常被用于分析紫花苜蓿生产力形成的两个重要指标[16]。因此，植株密度和土壤含水量互作下紫花苜蓿植株性状和叶片的变化特征，是查清植株密度和土壤含水量耦合时紫花苜蓿栽培草地稳定高产的途径之一。

土壤含水量和植株密度处于耦合状态时，已被证实能够提高禾本科植物水稻(Oryza sativa)的光合速率[17]、玉米(Zea mays)的株高和茎粗等植株性状[18]，然而土壤水分和植物密度互作是否能够改善豆科牧草紫花苜蓿植株性状和叶片特征，尚需要科学试验提供证据。因此，本研究采用盆栽试验，分析不同土壤含水量和植株密度互作对紫花苜蓿植株性状和叶片特征的影响，以期完善土壤含水量和植株密度互作影响植物植株性状和叶片特征的研究内容，服务于紫花苜蓿稳产高产。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验采用盆栽试验，设计为双因素处理，两个因素分别为土壤含水量和植株密度。土壤含水量设4 个梯度水平[19]，由于紫花苜蓿适宜生长的土壤含水量为田间饱和含水量的70%[19]，因此4 个土壤水分梯度分别设为土壤田间饱和含水量的85%～90%(W1湿润)、75%～80% (W2适宜)、60%～65% (W3轻度干旱胁迫)、35%～40% (W4重度干旱胁迫)。植物密度设计为3 个水平[12]，分别为10 (D1)、15 (D2)和20 株·盆-1(D3)，相当于210、315 和420万株·hm-2。试验共12 个处理，每处理3 个重复，共计36 盆。

试验在兰州大学榆中试验站日光智能温室进行。供试的紫花苜蓿品种为‘直布罗陀’(Gibraltar)，来自甘肃省亚盛田园牧歌草业集团公司，该品种是甘肃河西走廊主要紫花苜蓿品种之一。试验选用顶部直径为25 cm，底部直径为20 cm，高为28 cm 的塑料盆。土壤源于甘肃榆中盆地农田的耕作层，类型为沙壤土，其土壤田间饱和持水量为20.24% (质量含水量)[20]，pH 为7.4，有机质含量为0.66%，全氮含量为0.11%，速效磷和速效钾含量分别为5 766 和240 mg·kg-1[21]。

首先，用筛孔为0.5 cm 的铁筛剔除土壤中的植物根、石块等杂质，再将土壤置于180 ℃烘箱中高温灭菌48 h，后将土壤与尿素(N 含量34.5 kg·hm-2)、过磷酸钙(P 含量8.0 kg·hm-2)[22]充分搅拌混合，最后每盆装添加肥料的土壤11.3 kg。装好36 个盆后，于2018年10月14日播种，每盆播种籽粒饱满、大小均匀的苜蓿种子80 粒，土壤水分维持于70%～75%。2018年11月14日紫花苜蓿出苗至3 叶期时，人工间苗，将每盆的植株密度调至试验设计水平，间苗时每个花盆尽量保留长势良好、生长均一的苗，从人工间苗到紫花苜蓿分枝期，土壤水分依然维持于70%～75%，以利于幼苗的正常生长。分枝期开始，采用增加或减少灌溉水量的策略，将每个花盆的土壤含水量逐渐调至试验设计要求，2018年12月4日完成。此后每个花盆土壤含水量均维持于70%～75%。土壤含水量采用称重法，每隔2 d 根据需求浇水一次，浇水时间为18：00，尽可能地保持土壤含水量维持于试验设计的范围内。试验期间每周随机调整花盆位置，便于紫花苜蓿生长的通风和光照资源相对均匀，随时观察花盆内杂草生长，一旦发现杂草立刻手动清除。

1.2 取样和指标测定

本研究采用株高、分枝数、根颈直径、主根长和主根直径评价植株性状特征，采用叶绿素、叶面积、叶片干重、比叶面积评价紫花苜蓿叶片特征。取样时间为紫花苜蓿初花期，具体日期为2019年6月15日。

首先，每个盆中随机摘取健康叶片100 片，测定每片叶片的叶宽和叶长，采用曹亦芬等[23]的方法计算单个叶片的叶面积，后将叶片置于铝盒，放入70℃烘箱中烘48 h 称重，利用叶片面积和叶片重量计算比叶面积。其次，测定盆中每株紫花苜蓿的株高和一级分枝数，其平均值作为该盆的紫花苜蓿单株株高和分枝数，然后人工齐土壤表面收获地上部分，分离茎叶，其中叶片放入冰盒中保存，于实验室内采用丙酮提取法测定叶绿素含量[24]。最后，采用整体收获紫花苜蓿地下部分(包括根颈)，轻轻用手刨开土壤表层，露出根颈，采用游标卡尺测定根颈直径，采用钢卷尺测定主根长度，然后采用游标卡尺测定主根直径，测定位置为根颈向下2 cm[25]。

1.3 数据统计与分析

采用 One-Way ANOVA 检验各个指标数据的方差齐性，若方差不齐性，则采用对数转化数据，使其满足方差齐性，若方差还不齐性，则采用非参数检验。然后采用 Two-Way ANOVA 检验土壤含水量与植株密度互作对各个被遴选指标的显著性影响，若植株密度和土壤含水量互作不显著，则不做进一步分析；若植株密度和土壤含水量互作对某一个指标的影响显著，采用Tukey 比较法进行多重比较。使用MATLAB 拟合该指标与植株密度和土壤含水量之间的关系，建立二元回归模型，利用fminsearch 函数寻优，获取理论最佳值。

2 结果与分析

2.1 土壤水分和植株密度互作对紫花苜蓿株高、分枝数和根颈直径的影响

土壤水分显著影响了紫花苜蓿的株高、分枝数和根颈直径 (P＜0.05)；植株密度和土壤水分与植株密度互作显著影响了紫花苜蓿的根颈直径，但对株高和分枝数没有显著影响(P＞0.05) (表1) 。随土壤含水量增加，紫花苜蓿株高、分枝数和根颈直径均呈先增高后降低的趋势，当土壤含水量为饱和含水量的W2(75%～80%) 时3 个指标均达到峰值。随植株密度增加，紫花苜蓿根颈直径呈下降趋势，表现为10 株·盆-1(D1) 和15 株·盆-1(D2)均显著高于20株·盆-1(D3) (P＜0.05)，但D1和D2间无显著差异。

表1 土壤水分和植株密度互作对紫花苜蓿株高、分枝数和根颈直径的影响Table 1 Effects of soil water and plant density interaction on plant height,branch number and root neck diameter of alfalfa

紫花苜蓿根颈直径F(X1，X2)与土壤含水量(X1)和植株密度(X2) 间的数学拟合方程为F(X1，X2) ＝0.301 38 ＋ 0.030 24X1＋ 0.040 91X2-0.000 007 15X12-0.000 007X22-0.000 068 57X1X2，F检验时，P=0.038 99，R2＝ 0.640 55，说明土壤含水量、植株密度与紫花苜蓿主颈直径具有显著回归关系。X1、X2的一次项系数均为正值，说明土壤含水量和植株密度对根颈直径表现为正效应，且植株密度(X2)系数大于土壤含水量(X1)系数，说明一定范围内，植株密度增加对紫花苜蓿根颈直径效应大于土壤含水量的效应；X1、X2的二次项系数均为负数，表明该面为开口向下的抛物面(图1) 。fminsearch 寻优结果表明，植株密度为15.1 株·盆-1和土壤含水量为75.6%时，紫花苜蓿根颈直径最大，约为2.21 mm。

图1 土壤水分和植株密度互作下紫花苜蓿根茎直径曲面图和等高线图Figure 1 3D response surface of main stem diameter of alfalfa between soil moisture and plant density contour map

2.2 土壤水分和植株密度互作对紫花苜蓿主根长的影响

土壤水分对紫花苜蓿主根长影响显著(P＜0.01)，而植株密度及土壤水分和植株密度互作对紫花苜蓿主根长均无显著影响 (表2)。随土壤含水量的增加紫花苜蓿主根长呈上升趋势，其中W1(85%～90%)和W2(75%～80%)处理均显著高于W4(35%～40%)处理(P＜0.05)，其中在W2处理下主根长达到峰值，为29.87 cm。

表2 土壤水分和植株密度互作对紫花苜蓿主根长的影响Table 2 Effects of soil moisture and plant density interaction on the taproot length of alfalfa

2.3 土壤水分和植株密度互作对紫花苜蓿主根直径的影响

植株密度对紫花苜蓿主根直径有显著影响 (P＜0.05)，但土壤水分、土壤水分与植株密度互作对紫花苜蓿主根直径无显著影响(表3)。随植株密度的增加紫花苜蓿主根直径呈逐渐降低的趋势，其中D3显著低于D1和D2，D1和 D2间无显著差异 (P＞0.05)。

表3 土壤水分和植株密度互作对紫花苜蓿主根直径的影响Table 3 Effects of soil moisture and plant density interaction on taproot diameter of alfalfa

2.4 土壤水分和植株密度互作对紫花苜蓿叶面积、叶片干重和比叶面积的影响

土壤水分显著影响了紫花苜蓿的叶面积和叶片干重，但没有显著影响比叶面积；植株密度显著影响了紫花苜蓿叶面积、叶片干重和比叶面积；土壤水分和植株密度互作对紫花苜蓿的叶面积、叶片干重和比叶面积均没有显著影响 (表4)。

表4 土壤水分和植株密度互作对紫花苜蓿叶面积、叶片干重和比叶面积的影响Table 4 Effects of soil water and plant density interaction on leaf area,leaf dry weight and specific leaf area of alfalfa

随土壤含水量的增加，紫花苜蓿叶面积和叶片干重呈增加趋势，其中叶面积表现为W1和W2、W3和W4处理间均无显著差异(P＞0.05)，叶片干重的W1处理显著高于W3和W4(P＜0.05)，但W3和W4间差异不显著 (P＞0.05)。随植株密度的增加，紫花苜蓿叶片干重呈下降趋势，但比叶面积呈上升趋势，其中D1处理下叶片干重达到最大值，为0.02 g，而D3处理下比叶面积最大，为147.69 mm2·g-1。

2.5 土壤水分和植株密度互作对紫花苜蓿叶绿素的影响

土壤水分和植株密度对紫花苜蓿叶绿素a、b 和a/b 均具有显著影响(P＜0.05)，但两者间互作对紫花苜蓿叶绿素a、b 和a/b 影响均不显著(P＞0.05)(表5)。随植株密度增加，紫花苜蓿叶绿素a 和b 含量均呈先增加后降低的过程，其中D2处理下叶绿素a 和叶绿素b 含量达到峰值，分别为14.52 和4.91 mg ·g-1；而此时叶绿素a/b 最低，为3.00%，且显著低于D1(P＜0.05)，但与D3处理间无显著差异(P＞0.05)。当土壤含水量低于土壤饱和含水量的75%～80%时，紫花苜蓿叶绿素a 和b 含量呈下降趋势(P＜0.05)，而叶绿素a/b 变化均较为复杂，其中W4处理显著高于W2和W3(P＜0.05)，但W1和W4、W2和W3两组处理间均无显著差异(P＞0.05)。

表5 土壤水分和植株密度互作对紫花苜蓿叶绿素a、叶绿素b 含量和叶绿素a/b 的影响Table 5 Effects of soil moisture and plant density interaction on chlorophyll a,chlorophyll b content and chlorophyll a/b of alfalfa

3 讨论与结论

植株性状和叶片特征是解读紫花苜蓿对干旱区环境适应性的重要途径之一，也是评价紫花苜蓿种植栽培草地维持产量的重要指标。本研究结果表明，土壤含水量和植株密度互作并未显著影响紫花苜蓿株高、分枝数、主根直径和主根长，但显著影响了根颈直径；土壤含水量和植株密度分别显著影响了紫花苜蓿的株高、分枝数、主根长和主根直径。紫花苜蓿株高、分枝数、根颈直径、主根直径和主根长均随土壤含水量增加表现为先增高后降低过程，主要是由于土壤水分过少时，减少了植物细胞的扩张生长，进而抑制植物生长[26]。土壤水分过多时，不利于紫花苜蓿根系垂直生长[9]，植物主根直径和长度降低，对紫花苜蓿吸收土壤养分有负面效应，从而一定程度上抑制了紫花苜蓿地上部生长，导致株高降低。随紫花苜蓿植株密度增加，紫花苜蓿的根颈直径和主根直径均呈下降趋势，主要是随着植株密度增加，植株个体间竞争资源的能力加剧，每个单株个体获得资源的能力相对降低，导致根颈直径和主根直径降低。苜蓿根颈不仅是紫花苜蓿一级分枝枝条的重要部位[27-28]，也是紫花苜蓿吸收、运输、储存养分和水分的重要器官，直接影响紫花苜蓿的再生性[27,29]和抗旱性[30]，关系紫花苜蓿的生产性能和可持续利用[27,31]。根颈直径越粗，越有利于形成更多的一级分枝数。本研究表明，植株密度和土壤含水量互作对根颈直径具有最优理论值，说明当土壤含水量和植物密度达到耦合状态时，紫花苜蓿根颈直径最大，而不是植株密度越大或土壤含水量越高，其根颈直径越大。植株密度和土壤含水量处于耦合状态时，根颈直径最大，理论上此时紫花苜蓿潜在的一级分枝数应最大，但研究结果却表明植株密度和土壤含水量互作对紫花苜蓿一级分枝数没有理论最大值，说明紫花苜蓿一级分枝数的潜力，要变为生产实际，还存在诸多的机制过程，因此，今后应该加强土壤含水量和植株密度互作对紫花苜蓿植株性状不同指标影响机制的研究。

土壤含水量和植株密度互作均未显著影响紫花苜蓿叶面积、叶片干重、比叶面积和叶绿素含量，但土壤含水量和植株密度却分别显著影响了紫花苜蓿叶面积、叶片干重、比叶面积和叶绿素含量。紫花苜蓿叶面积和叶片干重随土壤含水量的增加呈逐渐增高的趋势；叶绿素a、叶绿素b 呈先增高后降低的过程，主要是土壤水分较大时，紫花苜蓿长势较好，主要能量用于扩展叶面积，而不是积累叶绿素[32]，而土壤水分较少时，影响了细胞的扩大和增殖，极大地限制了紫花苜蓿叶片的扩展，进而使紫花苜蓿叶片的叶面积减小，叶绿素含量降低，紫花苜蓿群体叶片光合性能下降[32]。随植株密度的增加，紫花苜蓿的叶面积，叶片干重呈逐渐下降的趋势；叶绿素a 和叶绿素b 呈先增高后降低的过程，说明植株密度过大不利于叶片展开，导致叶面积降低，同时加剧了紫花苜蓿个体植株根系竞争地下土壤资源的强度，客观上不利于叶片叶绿素含量增加，这会减少叶片吸收光能的能力[33]。植株密度过高时叶片叶绿素含量下降，主要是高密度时紫花苜蓿群体内通风和透光率差，个体间营养和生存空间竞争激烈，且呼吸消耗增多，最终因单株获取光照资源能力不充分，形成叶绿素含量较低的现象[34]。

紫花苜蓿植株性状和叶片特征对土壤含水量和植株密度互作的影响存在不一致，其中土壤含水量和植株密度互作没有明显影响紫花苜蓿叶片特征，而对植株性状指标的影响不一致。本研究所选的植株性状指标中，土壤含水量和植株密度互作仅显著影响了根颈直径，未影响其他指标，说明需要采用更多的植株性状指标去分析土壤含水量和植株密度互作对植株性状的影响。从根颈直径对土壤含水量和植株密度的响应分析，植株密度为15.1 株·盆-1和土壤含水量为75.6%时，根颈分枝能力较佳，有利紫花苜蓿生长。