滇重楼根际土壤解无机磷细菌的分离与鉴定

朱芙蓉，杜慧慧*，周 浓，*，杨 敏，郭冬琴，赵顺鑫，李庆天

（1.重庆三峡学院生物与食品工程学院，三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室，重庆 404120；2.大理大学药学与化学学院，云南 大理 671000）

具有清热解毒、抗癌抑菌等功效的药用植物滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis）是自然繁殖率低、生长缓慢的多年生草本植物，人类的肆意采挖致使其野生资源匮乏，已严重威胁医药产业的可持续发展［1］。高效引种栽培可缓解供不应求的现状，但科学合理施肥是提升滇重楼产量和品质的关键［2］。磷元素作为植物生长的必需元素之一［3］，在土壤中的含量较高，但大多以难溶性物质存在，不能直接被植物吸收利用，故常增施磷肥来满足植株对磷元素的需求［4］。由于土壤的理化性质和磷酸盐的化学行为，磷肥的利用率只有10%～25%，大量磷元素以无效态形式存在，减少了磷的有效性［5-6］。长期施用化学肥料，会导致土壤板结，水体污染严重［7］，不符合绿色、可持续发展的理念。

作为土壤系统一部分的解磷微生物能够将难溶性磷转化为可溶性磷，进而提高土壤有效磷的含量，有利于植株对磷元素的吸收利用。解磷微生物的种类较多，包括细菌、真菌以及放线菌等［8］，其中解磷细菌的数量最多，是解磷真菌的2～50倍［9］。目前关于解无机磷菌株的筛选多集中于农作物，如玉米、花生、大豆等［10-12］，对于药用植物解无机磷细菌的筛选还未见报道。

本研究分别从四川、云南、贵州中10个不同地点分别采集移栽品和野生品滇重楼，通过稀释根际土壤筛选解无机磷细菌，通过观察菌落，分析其生理生化，利用16S rDNA分子测序分离鉴定解无机磷菌株，为滇重楼微生物菌肥提供解无机磷的优良菌种，有助于提高滇重楼品质和产量。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采集样品根茎周边0～0.5 cm附着土壤，除去木质、石块等杂质，混匀，放入无菌自封袋，4℃冰箱保存。滇重楼采集信息见表1。

表1 不同产地滇重楼样品来源

1.2 培养基

无机磷固体培养基：琼脂15 g，无机磷培养基17 g，蒸馏水1000 mL，1×105Pa 灭菌20 min。

种子液培养基：牛肉膏3 g，NaCl 5 g，蛋白胨10 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.4～7.6，1×105Pa灭菌20 min。

无机磷液体培养基：葡萄糖10 g，（NH4）2SO40.5 g，Ca3（PO4）25.0 g，NaCl 0.3 g，FeSO40.03 g，KCl 0.3 g，MgSO40.3 g，MnSO40.03 g，蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.5，1×105Pa灭菌20 min。

1.3 菌株分离与纯培养

称取样品土壤1 g，置于9 mL无菌水中，振荡3 h，制备成10-6～10-1梯度的土壤稀释液。吸取100 μL稀释液，接种于已灭菌的培养基中，使用灭菌涂布棒涂抹均匀，37℃恒温培养3～4 d后，挑取有解磷圈的菌株划线纯化细菌，重复3次。观察并记录培养基上菌株的菌落形态、大小及颜色，并进行革兰氏染色。取单菌落菌株与50%甘油1∶1混合，-20℃保种。

1.4 解无机磷能力的测定

将菌株接种到无机磷固体培养基上培养3～4 d，测定解磷圈直径（D）和菌落直径（d），计算D/d值，用以表示菌株的解磷能力。

使用种子液活化菌种48 h后吸取500 μL种子液接种于无机磷液体培养基中，无菌水为空白对照，置于37℃、180 r/min培养7 d。7 d后离心发酵液，取其上清液，采用钼锑钪比色法测定有效磷的浓度［13］，用pH计测定上清液的pH值。

1.5 菌株鉴定

1.5.1 菌株生理生化特性测定

参照《常见细菌系统鉴定手册》［14］，将纯化的解无机磷菌株进行接触酶实验、淀粉水解实验、硝酸还原实验、吲哚实验、柠檬酸实验、精氨酸双水解实验、蔗糖发酵实验、葡萄糖发酵实验、M.R实验、尿素酶实验、明胶实验。

1.5.2 细菌16S rDNA分子生物学鉴定

参照天根细菌基因组DNA提取细菌总DNA，并进行浓度测定和纯度分析。利用16S rDNA扩增引物27F-1115R（27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1115R：5-AGGGTTGCGCTCGTTGC-3）［15］，对 菌 株进行PCR扩增，PCR反应程序如下：95℃ 6 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃10 min；4℃保存。PCR反应体系：2×PCR预混液10 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、模板1 μL，补水至20 μL。使用1%琼脂糖凝胶纯化并回收PCR产物，检测后交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。利用MEGA 5.0进行系统发育树的建立：使用Clustal W多重序列比对所需序列，采用Neighbor-joining 算法构建系统发育树。

1.6 数据分析

采用Excel 2016进行数据分析，MEGA 5.0进行进化树构建。利用SPSS 25.0和GraphPad Prism 8进行数据分析和作图，对不同菌株的可溶性指数、有效磷浓度、增磷量等进行单因素方差分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 解无机磷菌株的菌落特征

从不同生境的滇重楼根际土壤中分离纯化得到42株解无机磷菌株，其菌落形状多为圆形，中间扁平或凸起，颜色多为米白色或白色，大多表面湿润，菌落边缘大部分不整齐。

2.2 解无机磷能力测定

2.2.1 解无机磷能力的定性测定

将筛选出的42株解无机磷菌株培养后，测量解磷圈直径（D）和菌落直径（d），比较可溶性指数D/d值，初步得到菌株的解磷能力。由表2可知，Y2-2菌株的D/d值最大，为3.65；其次是Y6-2、Y8-3、Y1-1（D/d值 分 别 为3.31、2.86、2.73）。结合显著性分析发现，不同菌株的解磷能力不同。

表2 解无机磷菌的菌落直径、解磷圈直径以及两者的比值（n=3）

2.2.2 解无机磷能力的定量测定

通过钼锑钪比色法测定42株解无机磷菌株菌液中有效磷的含量。由表3和图1分析可知，菌株Z3-4解磷能力最强，发酵上清液中有效磷的含量为104.10 mg/L、增磷量为38.55 mg/L、解磷率为37.03%；其次为Y7-4、Y1-1、Y9-1。42株菌株发酵液的pH为3.93～5.70，均显著下降。其中，Z3-4菌株增磷量最高，但pH为4.31，不同解磷菌在溶磷过程中pH下降的程度不同，但与菌株溶磷量无明显的数量关系。

表3 有效磷含量及菌液pH值（n=3）

图1 42株解无机磷细菌的解磷率

2.3 解无机磷细菌生理生化特征

将42株解无机磷菌株进行革兰氏染色和生理生化实验测定。结果显示，42株解无机磷菌都是革兰氏阳性细菌，其中接触酶均为阳性，吲哚反应均为阴性；其淀粉水解、硝酸还原、柠檬酸、精氨酸双水解、蔗糖发酵、葡萄糖发酵、M.R、尿素酶以及明胶反应均呈现不同结果。

表4 解无机磷菌株的理化特性

续表

图2 部分解无机磷菌的16S rDNA系统发育树

2.4 16S rDNA测定与系统发育树构建

结合形态观察和淀粉水解、葡萄糖发酵及明胶反应等生理生化实验，进行16S rDNA序列分析。结果显示，19株菌株均归属于芽孢杆菌属，初步鉴定菌株Y1-2、Y4-1、Y4-2和Z7-4归属于苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），菌株Y1-1、Y5-1、Z8-1归属于蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），菌株Y2-3归属于惠州芽孢杆菌（Bacillus huizhouensis），菌株Y8-3归属于安全芽孢杆菌（Bacillus safensis），菌 株Y6-1、Z10-1归 属 于 短小芽孢杆菌（Bacillus pumil），菌株Y8-1、Y9-1、Z1-1、Z3-4、Z6-1、Z7-1归属于阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai），其中阿氏芽孢杆菌（6株解无机磷菌）是优势菌种，其次是苏云金芽孢杆菌（4株解无机磷菌）。

3 讨论

通过解磷圈和钼锑钪比色法测定42株解无机磷菌株后发现，可溶性指数最高的菌株为Y2-2（D/d为3.65）、增磷量为4.28 mg/L，而增磷量最高的菌株为Z3-4（D/d为2.18）、增磷量为38.55 mg/L。因此，单纯从可溶性指数（解磷圈D与菌落直径d比值）并不能直接判断解磷能力，需要结合培养基中增磷量来预测。

解无机磷细菌可与铁、铝、钙、镁等离子结合，使难溶性磷酸盐溶解释放磷元素［16］。而分泌有机酸是溶磷微生物溶磷的主要途径之一，有机酸能够降低pH［17-18］。发酵上清液的pH均比种子液pH低，推测解无机磷菌在解磷的过程中与培养基中的Ca3（PO4）2反应，产生了酸性物质，从而引起pH的下降，但是詹寿发等［19］认为培养介质的pH下降不是溶磷的必要条件。不同解磷菌的解磷能力不同，导致pH下降的程度存在明显差异，表明培养基质pH的下降与解磷量不呈线性关系［20］。

解无机磷菌的种类较多，目前研究较多的主要有芽孢杆菌属（Bacillus）、假单孢菌属（Pseudomonas）、节杆菌属（Arthrobacter）、色杆菌属（Chromobacterium）以及分枝杆菌属（Mycobacterium），主要应用解磷巨大芽孢杆菌生产溶磷菌肥［21-22］。不同土壤中解磷菌的数量和种群特征存在较大差异，且根际环境适宜解磷微生物生长，表现出强烈的根际效应［23］。本研究从云南、贵州以及四川中10个不同地区采集的滇重楼根际土壤中筛选出42株解无机磷菌，经鉴定菌株均属于芽孢杆菌属，其中阿氏芽孢杆菌为优势菌种。下一步研究将解磷效果最好的菌株Z3-4回接到滇重楼根际土壤并探究解无机磷菌的解磷机制，对开发生物菌肥具有重要的参考意义。

4 结论

将20份不同生境滇重楼根际土壤样本分离纯化，获得42株解无机磷菌，通过解磷能力的定性和定量测定，筛选出解无机磷能力较强的菌株有菌株Y1-1、Y6-1、Y7-1、Y8-3和Z3-4，其中菌株Z3-4的解无机磷能力最强，其发酵液中的有效磷含量为104.10 mg/L，增磷量达到38.55 mg/L。结合菌株Z3-4的菌落形态、生理生化特性、16S rDNA测序结果，初步鉴定菌株Z3-4为阿氏芽孢杆菌。