基于网络药理学探寻β-谷甾醇的作用机制

王旭红 刘改霞 李耀辉 李哲 张涛

摘要 目的：通過网络药理学分析探寻β-谷甾醇的潜在作用机制。方法：首先，利用PubChem数据库下载β-谷甾醇的2D结构，利用PharmMapper数据库预测靶标信息，再将结果中输入UniProt数据库提取靶标的基因名，然后利用TTD数据库查询到靶标对应的疾病信息，STRING数据库构建基因功能关联网络，利用DAVID数据库进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析。结果：PharmMapper共得到靶标223个，从TTD数据库得到疾病信息86个，基因功能关联网络度值较高的基因有RAC1、B2M、ESR1、GTF2F2、AR和KDR，GO富集分析中具有显著意义的4个条目有RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录起始、类固醇激素受体、类固醇激素介导的信号通路和肽基酪氨酸自磷酸化，通路富集分析中有显著意义的通路11条，分别为Rho-GTPase循环、NRAGE通过JNK发出死亡信号、神经营养素信号通路、基础转录因子、MyD88缺陷（TLR2/4）、IRAK4缺乏症（TLR2/4）、DAP12信号、β-丙氨酸代谢、卵母细胞减数分裂、Rap1信号通路和MyD88：MAL（TIRAP）在质膜上启动的级联反应。结论：β-谷甾醇可以通过多靶点，多通路作用于神经系统、生殖系统、免疫系统、感染性疾病及肿瘤在内的多种疾病。

关键词 β-谷甾醇;植物甾醇;胆固醇;网络药理学;炎症;肿瘤;中医;作用机制

Mechanism of β-Sitosterol Based on Network Pharmacology

WANG Xuhong1，LIU Gaixia2，LI Yaohui3，LI Zhe4，ZHANG Tao2

（1 Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China; 2 Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China; 3 Shaanxi Provincial Hospital of Chinese Medicine，Xi′an 710000，China; 4 Traditional Chinese Medicine Development Research Center，Chinese Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China）

Abstract Objective：To explore the underlying mechanism of β-sitosterol through network pharmacology.Methods：Firstly，the 2D structure of β-sitosterol was downloaded from PubChem，and targets were predicted by PharmMapper.The results were input into UniProt to extract the gene names of targets.The disease information corresponding to the targets was retrieved from TTD.STRING was used for the construction of an association network of gene functions and DAVID for GO and pathway enrichment.Results：A total of 223 targets and 86 pieces of disease information were obtained from PharmMapper and TTD，respectively.Genes with high degrees in the association network of gene function included RAC1，B2M，ESR1，GTF2F2，AR，and KDR.Four significant items in the GO enrichment analysis were transcription initiation of RNA polymerase Ⅱ promoter，steroid receptor，steroid-mediated signaling pathway，and peptide tyrosine autophosphorylation.There were 11 significant pathways in the pathway enrichment analysis，including Rho-GTPase cycle，NRAGE signals death through JNK，neurotrophin signaling pathway，basic transcription factor，MyD88 deficiency（TLR2/4），IRAK4 deficiency（TLR2/4），DAP12 signaling pathway，β-alanine metabolism，oocyte meiosis，Rap1 signaling pathway，and MyD88：MAL（TIRAP） cascade initiated on the plasma membrane.Conclusion：The findings of this study reveal that β-sitosterol can act on various diseases including nervous system，reproductive system，immune system，infectious disease，and tumors through multi-target and multi-pathway.

Keywords β-sitosterol; Phytosterol; Cholesterol; Network pharmacology; Inflammation; Tumor; Traditional Chinese medicine; Mechanism of action

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.02.005

β-谷甾醇（Beta-Sitosterol）是植物中的一种主要膳食甾醇，存在于油脂、坚果和蔬菜等多种植物当中[1]。其中植物油含有最高浓度的植物甾醇，坚果和种子含有适量的植物甾醇，而水果和蔬菜通常含有最低的植物甾醇[2]。胆固醇通过氧化过程产生胆固醇氧化产物从而成为动脉粥样硬化的重要危险因素，β-谷甾醇又分类为非胆固醇固醇或中性固醇，虽然在结构上与胆固醇相似，也可能经历与胆固醇类似的氧化过程，并产生类似的氧化产物，但是这些氧化物的功能却是通过破坏胆固醇胶束的形成降低胆固醇水平[3]。同时β-谷甾醇也被用于治疗其他疾病，包括前列腺增生、炎症、肿瘤等，因此人们对植物甾醇和β-谷甾醇的兴趣与日俱增[4]。前期进行网络药理学研究时，在检索及筛选中药有效成分及靶标的过程中发现多药物中均含有β-谷甾醇，并且其口服生物利用度（OB）和类药性（DL）2个值均较高，如冬虫夏草、郁金、苍耳子、鸦胆子等。基于中药学而言，上述四味中药分属不同章节，主治及功效也大不相同。现代药理学研究证实β-谷甾醇具有治疗高脂血症、类风湿性关节炎、免疫抑制、前列腺增生、脱发、烧伤等多种疾病的功效[5]。为进一步了解该成分的作用靶点及可治疗的疾病从而提供理论支撑，本研究采用网络药理学方法对其靶点和作用机制进行可视化分析。

1 资料与方法

1.1 β-谷甾醇靶标的预测

利用PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），以“Beta-sitosterol”作为检索词进行检索，进一步打开“Beta-sitosterol”条目即可看到该成分的2D结构，将2D结构保存为SDF格式进一步分析。见图1。利用PharmMapper数据库（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），点击“Submit Job”上传上述2D结构的SDF文件、填写自己邮箱，其他相关信息默认该数据库的设置，最后点击“Submit”提交完成。待该数据库靶标信息预测完成之后，即可下载CSV格式的分析结果，将结果中UniProt一栏的靶标编号分别输入UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）提取靶标的基因名称即可完成靶标预测。

1.2 β-谷甾醇潜在治疗疾病的预测

首先打开TTD数据库（http：//db.idrblab.net/ttd/），将1.1中转换后的靶标输入“Search for Targets”搜索框，选择“Target Name”与靶标相符的基因点击“Target Info”查看靶标的详细信息，其中“Disease”一栏即为靶标可能有关的疾病。然后将可查询到疾病信息的靶标和其相关的疾病列表，将表格导入Cytoscape软件进行网络构建，并根据靶标和疾病进行图形调整。

1.3 基因功能关联网络

STRING数据库（https：//string-db.org/）是最常用的蛋白数据库，可通过其构建基因功能关联网络。首先选择Multiple Proteins，将预测的靶标输入搜索框中，Organism选择为“Homo Sapiens”开始搜索，搜索完成后点击“Continue”，在设置中将分数选择为0.7，并隐藏散在的节点，即可得到蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的网络图。

1.4 基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析

DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）是较为全面的生物功能注释信息平台，将预测的β-谷甾醇靶点基因名称输入DAVID，数据类型选择“OFFICIAL GENE SYMBOL”，表格类型选择“Gene List”，物种类型和背景均选择“Homo Sapiens”，再选择“Functional Annotation Tool”即可选择进行GO富集分析和通路富集分析。进行GO富集生物过程以及通路富集信号通路的筛选时限定条件为P<0.05并且FDR<0.05以及所研究疾病的相关性。

2 结果

2.1 β-谷甾醇的靶标

通过PubChem搜索得到β-谷甾醇的2D结构。见图1。PharmMapper的预测（Job ID：200305035857）和UniProt转换，共得到靶标223个，将化合物和靶标导入Cytoscape软件进行“化合物-靶标”网络构建，其中绿色代表化合物，黄色代表所预测的靶标。见图2。

2.2 β-谷甾醇的疾病预测结果

通过TTD数据库对223个靶标进行疾病预测，其中有疾病信息的基因52个，对疾病信息进行去重处理后得到疾病信息86个，将靶标和疾病信息导入Cytoscape数据库构建“靶标-疾病”网络，其中红色代表疾病信息，黄色代表靶标。见图3。拓扑分析发现Solid Tumour/Cancer、AR、KDR的节点度值较高。

2.3 β-谷甾醇的基因功能关联网络

為了更直观地了解β-谷甾醇的作用机制，将所得靶标输入STRING V11.0平台构建基因关联网络。见图4。网络中共包含221个节点，205条边，平均节点度值1.86。进行拓扑分析发现RAC1、B2M、ESR1、GTF2F2、AR、KDR等基因的节点度值高于其他靶点（>8），上述靶点可能在疾病的治疗中发挥关键作用，属于核心靶点。

2.4 GO富集分析和通路富集分析

共得到12个富集的生物过程聚类，分为58个条目，其中具有显著意义的4个条目为：RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录起始、类固醇激素受体、类固醇激素介导的信号通路、肽基酪氨酸自磷酸化。通路富集分析共获得9个富集的通路聚类，分为44条通路，P<0.05的通路11条，分别为Rho-GTPase循环、NRAGE通过JNK发出死亡信号、神经营养素信号通路、基础转录因子、MyD88缺陷（TLR2/4）、IRAK4缺乏症（TLR2/4）、DAP12信号、β-丙氨酸代谢、卵母细胞减数分裂、Rap1信号通路、MyD88：MAL（TIRAP）在质膜上启动的级联反应。见图5、表3。红色代表通路结果，绿色代表GO富集结果，黄色代表药物靶点。见图5。

3 讨论

β-谷甾醇是一种植物甾醇，它与胆固醇结构相似，但并在人类体内合成，而是通过肠道吸收来获取。相关研究显示β-谷甾醇的吸收量远小于胆固醇，口服生物利用度为0.41%，清除率为85 mL/h，周转率为5.8 mg/d[6]。β-谷甾醇的酯化速度比胆固醇慢，但转化为原胆汁酸、胆酸和鹅去氧胆酸的速度与胆固醇基本一致[7]。有研究表明β-谷甾醇抑制了培养的癌细胞系鞘磷脂周期的激活，阻滞细胞周期以及刺激凋亡细胞死亡[8]。除抗肿瘤外，也有研究证明其具有抗高胆固醇、炎症、抗菌和抗真菌的特性[9]。虽然目前关于β-谷甾醇的研究有限，但其作为一种天然产物被认为是安全的，并且抑制多种途径参与肿瘤的发生和发展。

本研究发现，β-谷甾醇基因功能关联网络度值较高的靶点有RAC1、B2M、ESR1、GTF2F2、AR、KDR，其中RAC1基因编码的蛋白是GTPase，属于小GTP结合蛋白的ras超家族，这一超家族的成员似乎调节着一系列不同的细胞事件，包括细胞生长的控制、细胞骨架的重组和蛋白激酶的激活，与RAC1相关的疾病包括精神发育迟滞、智力残疾综合征[10]。B2M基因编码一种血清蛋白，该蛋白与几乎所有有核细胞表面的主要组织相容性复合体I型重链相关，该蛋白具有主要的β折叠片状结构，在某些病理条件下可形成淀粉样纤维，与该基因相关的疾病包括免疫缺陷和淀粉样变性[11]。ESR1基因编码雌激素受体，雌激素及其受体对性发育和生殖功能至关重要，但也在乳腺癌、子宫内膜癌和骨质疏松症组织中发挥作用[12]。GTF2F2是一种蛋白质编码基因，其主要作用包括形成含有HIV-1 Tat和RNA聚合酶Ⅱ转录起始和启动子清除的HIV-1延伸复合物[13]。AR在骨髓、乳腺、前列腺组织中表达，编码的蛋白质有3个主要功能域：N末端域、DNA结合域和雄激素结合域，靶点作为类固醇激素激活的转录因子发挥作用[14]。血管内皮生长因子（VEGF）是内皮细胞的主要生长因子，KDR基因编码VEGF的2个受体之一是一种Ⅲ型受体酪氨酸激酶，该成分是血管内皮生长因子（VEGF）诱导内皮细胞增殖、成活、迁移、小管形态发生和萌发的主要介质[15]。本研究的靶点富集在11条通路上，其中Rho GTPase是一类重要的信号转导分子，主要作用是转换GTP的活化状态和非活化状态，在其中发挥开关作用[16]。NRAGE是一种p75神经营养蛋白受体相互作用蛋白，通过JUN依赖性线粒体途径诱导Caspase激活和细胞死亡，p75NTR与NRAGE相互作用从而导致JUN激酶（JUK）的磷酸化和活化，进一步诱导促凋亡基因的转录，并直接激活细胞死亡機制[17]。神经营养素是一类参与神经细胞分化和成活的营养因子，一方面，它通过与Trk酪氨酸激酶受体或p75神经营养素受体（p75NTR）结合发挥其功能，另一方面，p75NTR同时传输正信号和负信号，这些信号对神经发育和其他高阶活动如学习和记忆起着重要作用。基础转录因子是指真核基因转录除RNA聚合酶外还需要许多蛋白因子——转录因子参加，其中一些转录因子是RNA聚合酶Ⅱ转录起始必需的，并且可以维持基础水平的转录。在配体结合时，TLRs通过其各自的TIR结构域异源或均聚并招募MyD88，MyD88通过其死亡结构域（DD）和TIR结构域寡聚并与白细胞介素-1受体相关激酶（IRAKs）相互作用形成Myddosome复合物从而导致转录因子活化的信号[18]。IRAK4依赖的TLR7和TLR8信号事件与肝病病毒感染相关，MyD88和IRAK4缺陷患者至今尚未报道易受病毒感染[19]。白细胞介素-1受体相关激酶4（IRAK4）通过IRAK4的死亡结构域和适配型髓样分化因子88蛋白（MyD88）的同源性相互作用被招募到TLR受体复合物中，基于细胞的分析以及与IRAK4变体的体外蛋白质相互作用分析表明，缺陷IRAK4的功能丧失是由蛋白质生产的丧失或与MyD88的相互作用受损引起的，研究已确定患有常染色体隐性遗传（AR）型IRAK4缺乏症的患者，在婴儿期或幼儿期有临床症状，表现为复发性化脓性细菌感染[20]。在受体连接反应中，DAP12的免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM）中的酪氨酸残基被Src家族激酶磷酸化，这些磷酸酪氨酸在髓细胞中形成蛋白酪氨酸激酶SYK和NK细胞中的SYK和ZAP70的对接位点，所有这些中间信号分子导致激酶AKT、CBL和ERK的募集和激活，以及肌动蛋白细胞骨架的重排最终导致细胞活化[21]。β-丙氨酸的代谢主要在大脑和肌肉中，可以提高抗氧化能力和抗疲劳作用。Rap1是一种控制细胞黏附、细胞-细胞连接形成和细胞极性等多种过程的小GTPase，Rap1以高度依赖于细胞类型的方式调节MAP激酶（MAPK）活性，在非活性GDP结合构象和活性GTP结合构象之间循环，Rap1通过调节整合素和其他黏附分子在不同细胞类型中的功能，在控制细胞-细胞和细胞-基质相互作用中起主导作用[22]。MyD88包含一个N末端死亡结构域（DD）和一个C末端TIR，TIR同型相互作用的配体与激活的TLR接触，而DD模块招募丝氨酸/苏氨酸激酶，这些蛋白激酶的募集伴随着磷酸化，从而导致IRAKs与肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）的相互作用[23]。

綜上所述，β-谷甾醇可以通过多靶点、多通路作用于神经系统、生殖系统、免疫系统、感染性疾病及肿瘤在内的多种疾病。

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（2020-04-30收稿 本文编辑：魏庆双）