戊唑醇在猕猴桃中的残留行为及膳食摄入风险评估

付 岩 张 亮 王全胜 凌淑萍 吴银良

（宁波市农业科学研究院，农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（宁波），浙江宁波 315040）

猕猴桃（Actinidia chinensisPlanch）隶属于猕猴桃科猕猴桃属，因其营养丰富，富含维生素C、多种矿物质元素（钾、钙、磷等）及17种氨基酸，而被称为“水果之王”。猕猴桃已被列入由农业农村部颁布的《用药短缺特色小宗作物名录（2019版）》中，属于特色小宗作物[1～2]。近年来我国猕猴桃产业高速发展，2007—2018年，我国猕猴桃种植面积增长了3倍，产量增长了5倍，2018年全国猕猴桃种植面积24万hm2，占全球猕猴桃总种植面积的72%；总产量255万t，占全球猕猴桃总产量的55%，面积和产量均位居世界第1[3]。随着猕猴桃种植面积的不断扩大和树龄的增加，其病虫害的发生和危害程度也越来越严重，而化学农药使用是主要防治措施[4]。猕猴桃 （树）上有褐斑病、灰霉病、软腐病、炭疽病等近30种病害[5]。目前，我国在猕猴桃上登记使用的杀菌剂仅有7种，包括噻菌铜、春雷·噻唑锌、氟菌·肟菌酯等。与猕猴桃上复杂的病害发生情况相比，登记可用的农药依然偏少[6]。

三唑类杀菌剂戊唑醇（Tebuconazole）是甾醇脱甲基化抑制剂，能防治褐斑病、灰霉病等多种病害[7]，有望在猕猴桃上登记应用。目前已有戊唑醇在谷物[8～9]、 蔬菜[10]、 水果[7，11～12]等中的残留行为和风险评估相关报道。孙明娜等[7]使用气相色谱—氮磷检测器测定了戊唑醇在葡萄中的残留和消解动态，戊唑醇在葡萄中的半衰期为9.8～12.2 d。梁亚杰等[11]采用液相色谱串联质谱方法对戊唑醇在苹果中的残留行为及膳食风险进行了研究，结果表明，戊唑醇在苹果中的半衰期为9.4～21.7 d，以有效成分100 mg/kg，喷雾施药3次，施药间隔7 d，在推荐的安全间隔期采收，戊唑醇在苹果中膳食暴露风险指数＜100%。近年来国内对于猕猴桃上农药残留及风险评估研究关注逐渐增多[13～19]。虽然戊唑醇在猕猴桃实际生产中应用较多[5～6]，但目前猕猴桃中戊唑醇的残留行为及基于规范残留试验的膳食摄入风险评估未见相关报道，我国也尚未制定其在猕猴桃上的最大残留限量。因此，本研究在前人基础上，采用QuEChERS—超高效液相色谱—串联质谱（UPLC—MS/MS）法研究了戊唑醇在猕猴桃上的残留行为及对我国不同人群的长期膳食摄入风险评估，旨在为戊唑醇在猕猴桃上的登记及最大残留限量的制定提供基础数据。

一、材料与方法

（一）材料与试剂戊唑醇标准品 （纯度99.34%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH）；25%戊唑醇可湿性粉剂（江苏盐城双宁农化有限公司）；乙腈 （色谱纯，美国Sigma—Aldrich公司）；甲酸（色谱纯，美国Tedia公司）；氯化钠（分析纯，杭州瓶窑和顺化工试剂厂）；无水硫酸镁（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙二胺—N—丙基吸附剂（Primary secondary amine，PSA，40～63μm，天津艾杰尔公司）。

（二）仪器与设备Waters Xevo TQ—S超高相液相色谱—串联质谱仪 （美国Waters公司）；KS4000ic恒温振荡器（德国IKA公司）；3K15高速离心机（德国Sigma公司）；GENIUS3旋涡混合器（德国IKA公司）；Milli—QADVA10超纯水仪（德国Millipore公司）；万分之一电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

（三）田间试验设计根据《农药登记残留试验区域布局指南》要求，在浙江省宁波市海曙区、山东省潍坊市安丘市、山西省运城市平陆县、四川省成都市金堂县、河南省永城市茴村镇、陕西省西安市周至县6个试验点开展残留田间试验，其中山西省和四川省2个试验点包含消解试验。猕猴桃品种为 ‘徐香’（浙江、河南）、‘翠香’（山东）、‘华优’ （山西）、‘红阳’（四川）、‘海沃德’（陕西）。按《农药残留试验准则》要求设计试验小区，最终残留试验小区为2棵树，消解动态试验小区为2棵树，均设置3个重复，小区间设保护行，另设空白对照小区。根据良好农业规范（Good agricultural practices，GAP），25%戊唑醇可湿性粉剂在猕猴桃上防治褐斑病，推荐剂量为有效成分用药量：62.5～100.0 mg/kg；制剂用量：制剂稀释2 500～4 000倍液；施药方法：喷雾；施药间隔期：7 d；施药次数2次。设计施药剂量：猕猴桃消解动态试验按施药剂量150 mg/kg（制剂稀释1 667倍液）于猕猴桃植株喷药，采样距最后一次喷药的间隔时间为施药后2h，1、3、5、7、14、21 d；最终残留试验设2个施药剂量，低剂量按施药剂量100 mg/kg（制剂稀释2 500倍液），高剂量按施药剂量150 mg/kg（制剂稀释1 667倍液）施药，各设2次和3次施药，施药间隔期为7 d，采样距最后一次喷药的间隔时间为7、14、21 d。从≥4株果树上至少采集12个果实，总质量≥2 kg。田间采集的猕猴桃样品去柄后用不锈钢刀具剁碎后匀浆，四分法缩分，分取150 g样品2份，分别装入样品容器中，写好标签，并冷冻保存（保存温度≤—18℃）。

（四）样品提取和净化准确称取猕猴桃样品5 g置于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入20 mL乙腈，以350 r/min振荡提取30 min后，加入5.0 g氯化钠，涡旋振摇1 min，以4 000 r/min离心3 min。取2 mL上清液于5 mL离心管中，加入150 mg PSA和300 mg无水硫酸镁，涡旋后以4 000 r/min离心3 min。取0.4 mL上清液至另一试管中并加入纯水至1.0 mL，混合均匀，过0.22μm滤膜供UPLC—MS/MS测定。

（五）检测条件色谱柱：Acquity BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7μm）。流动相：A相为纯水，B相为乙腈。梯度洗脱条件：B相在0.5 min内保持40%后，在0.1 min内增至80%，保持2.9 min，然后在0.1min内降至40%，保持1.4min。流速：0.30 mL/min。进样量：10μL。离子源：ESI源正离子模式。检测方式：多反应监测（Multiple reaction monitoring，MRM）模式。毛细管电压：2.5 kV。锥孔电压：20 V。离子源温度：150℃。脱溶剂气温度：500℃。锥孔气流速：50 L/h。脱溶剂气流速：1 000 L/h。其他质谱参数见表1。

表1 质谱多重反应监测参数

（六）计算公式依据我国的膳食结构数据，结合残留化学评估推荐的规范残留试验中值和已制定的最大残留限量（MRLs），计算该农药的国家估算 每 日 摄 入 量 （National estimated daily intake，NEDI），计算方法见公式（1）[20]。

公式（1）中，STMRi（Supervised trials median residue）为戊唑醇在某一食品中的规范残留试验中值（mg/kg）；Fi（Food intake）为一般人群某一食品的消费量（g/d）。戊唑醇的长期膳食摄入风险用NEDI占每日允许摄入量（Acceptable daily intake，ADI）的百分比来表示，即膳食摄入风险商（Dietary risk quotient，RQd），计算方法见公式（2）。

RQd≤100%时，表示风险可以接受，处于安全水平；当RQd＞100%时，表示有不可接受的风险。

二、结果与分析

（一）标准曲线准确称取戊唑醇标准品0.010 0 g（精确至0.1 mg）于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成质量浓度为100 mg/L的标准母液。采用基质匹配外标法定量。将100 mg/L的戊唑醇标准母液用猕猴桃的空白基质提取液稀释配制成0.500 0、0.100 0、0.010 0、0.005 0、0.001 0、0.000 5 mg/L的系列标准工作液。按上述仪器条件进行测定。以标准溶液浓度为横坐标，定量离子对峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示戊唑醇在0.000 5～0.500 0 mg/L浓度范围内线性响应良好，线性方程为y＝3 049 805x+32 614，相关系数为0.997。在上述条件下，戊唑醇的最小检出量为5.0×10—12g。

（二）方法的灵敏度、准确度和精密度取猕猴桃空白样品进行回收率实验，添加戊唑醇标准溶液，使添加水平分别为0.01、0.10、1.00和2.00 mg/kg，每个浓度处理重复5次，按“一、材料与方法”中“（四）样品提取和净化”的方法进行提取、净化，按 “一、材料与方法”中 “（五）检测条件”进行回收率测定，同时做空白对照。结果如表2所示，戊唑醇在猕猴桃中平均添加回收率为89%～114%，相对标准偏差≤8.2%，定量限为0.01 mg/kg。该方法具有较好的准确度和精密度，能满足农药残留定量分析的要求。

表2 戊唑醇在猕猴桃中的添加回收率 （n＝5）

（三）戊唑醇在猕猴桃中的消解动态戊唑醇在猕猴桃上的消解较迅速，消解曲线见图1。1年2地试验结果表明，施药后当天采样检测，在猕猴桃中戊唑醇的初始残留量为0.67～0.89 mg/kg；21 d后，残留量为0.05～0.30 mg/kg。戊唑醇在猕猴桃中的降解动态符合一级反应动力学方程，消解曲线方程分别为：Ct＝0.942 6e—0.1104t（山西），相关系数为0.863 0；Ct＝0.805 1e—0.2635t（四川），相关系数为0.912 0。戊唑醇在山西、四川2地试验点的猕猴桃中的半衰期分别为6.3 d和2.6 d，属于易降解农药（t1/2＜30 d）[21]。山西试验点属暖温带大陆性季风气候，四川试验点属亚热带季风气候。消解试验期间（共21 d），两地平均气温分别为23.4～31.9℃（四川）、21.9～29.9℃（山西），平均降雨量分别为137.2 mm（四川）、104.7 mm（山西）。两地均为露地试验，推测气温较高、降雨量较大可能是四川试验点戊唑醇在猕猴桃中的半衰期稍短于山西试验点的主要原因之一。

图1 戊唑醇在猕猴桃中的消解动态

（四）戊唑醇在猕猴桃中的最终残留量6地戊唑醇在猕猴桃中的最终残留量试验结果见表3，结果表明，当施药剂量为100、150 mg/kg，施药次数为2次和3次时，距最后一次施药7 d后收获的猕猴桃中，戊唑醇残留范围为0.110～2.000 mg/kg，残留中值为0.630 mg/kg，残留最大值为2.000 mg/kg；距最后一次施药14 d后收获的猕猴桃中，戊唑醇残留范围为0.069～1.740 mg/kg，残留中值为0.510 mg/kg，残留最大值为1.740 mg/kg；距最后一次施药21 d后收获的猕猴桃中，戊唑醇残留范围为0.020～1.150 mg/kg，残留中值为0.325 mg/kg，残留最大值为1.150 mg/kg。

表3 戊唑醇在猕猴桃中的最终残留量

（五）长期膳食摄入风险评估

1.基于我国膳食数据的风险评估。戊唑醇在我国的登记作物有水稻、小麦、玉米、高粱、棉花、花生、大白菜、番茄、辣椒、黄瓜、苦瓜、马铃薯、柑橘树、苹果、梨树、枇杷、冬枣、葡萄、草莓、香蕉、西瓜、芒果、石榴、桃树、杨梅树、百合、贝母、苍术、金银花、麦冬、人参、三七、山核桃树、食用玫瑰、铁皮石斛、元胡、枸杞等[22]。根据我国规定的戊唑醇ADI（0.03 mg/kg bw，来源于GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》）及我国一般人群平均体重（63 kg）计算，得出一般人群戊唑醇的估算日摄入量为0.387 48 mg。戊唑醇的膳食摄入风险评估结果见表4，结果表明，通过已有的残留限量标准、试验中得到的14 d所对应的规范残留试验中值（0.510 mg/kg）及我国一般人群的日允许摄入量，计算得出全膳食风险概率为20.5%，其中摄入猕猴桃中戊唑醇对其全膳食暴露风险的贡献率仅为1.23%。该结果表明，猕猴桃中戊唑醇残留在我国一般人群中的膳食暴露风险水平较低，在猕猴桃上合理使用戊唑醇不会对一般人群健康产生不可接受的风险。目前，我国尚未规定戊唑醇在猕猴桃中的最大残留限量（MRLs），安全间隔期为14 d时，残留中值为0.510 mg/kg，残留最大值为1.740 mg/kg，根据膳食风险评估结果，推荐戊唑醇在猕猴桃中的最大残留限量为5 mg/kg。

表4 戊唑醇的膳食摄入风险评估

2.不同年龄段人群膳食摄入风险评估。鉴于猕猴桃可能是部分人群消费的重要水果品种，为保护绝大多数人膳食安全的需要，猕猴桃摄入量采用水果摄入量[23]。根据《中国居民营养与健康状况调查报告》[24]中不同年龄段人群的平均体重、水果摄入量以及本研究测得的残留中值，计算我国不同人群食用猕猴桃摄入戊唑醇的长期膳食风险（见表5）。结果表明，戊唑醇估算每日摄入量（EDI）为0.0124～0.027 2 mg，膳食摄入风险为0.758%～5.90%，均在可接受范围内（＜100%）。随年龄增加，风险商逐渐降低。因此根据本试验所得出的25%戊唑醇可湿性粉剂在猕猴桃上的最终残留试验结果，以施药剂量稀释1 667～2 500倍液，各设2次和3次施药处理，每次施药间隔7 d，在距最后1次施药14 d时戊唑醇在猕猴桃上的残留是安全的。

表5 不同人群中戊唑醇的长期膳食摄入风险评估

三、结论与讨论

目前对于戊唑醇在农产品中的残留检测已有相关报道，FANG等[12]采用超高效液相色谱法测定梨中的戊唑醇残留量，定量限为0.05 mg/kg。朱宇珂等[25]用乙腈提取，弗罗里硅土固相萃取柱净化，气相色谱氮磷检测器检测戊唑醇在番茄和土壤中的残留，番茄中戊唑醇的定量限为0.02 mg/kg。本文采用乙腈提取、PSA净化，缩短了前处理时间，同时最小检出量为5.0×10—12g，定量限为0.01 mg/kg，与已报道的方法相比，灵敏度和准确度较高，其回收率、精密度和灵敏度等参数均能满足农药残留量分析的技术要求。戊唑醇在猕猴桃中半衰期为2.6～6.3 d，属于易降解农药。戊唑醇在不同区域、不同作物上消解半衰期有一定差异，孙明娜等[7]研究发现，戊唑醇在安徽、河北2地葡萄中的半衰期为9.8～12.2 d，这可能与气候、栽培、果实生长过程中稀释作用等因素有关。梁亚杰等[11]研究表明，戊唑醇在辽宁、新疆、山东和山西4地苹果中的半衰期为9.4～21.7 d，其中戊唑醇在山西运城试验点苹果中半衰期为9.4 d，与本试验戊唑醇在山西运城猕猴桃中的半衰期6.3 d较为接近，可能是因为试验期间天气条件、生长稀释作用较为接近。我国和国际食品法典委员会目前均未制定猕猴桃中戊唑醇的最大残留限量，根据膳食摄入风险评估结果，25%戊唑醇可湿性粉剂，用于防治猕猴桃褐斑病，用药量2 500～4 000倍液（62.5～100 mg/kg），施药2次，推荐安全间隔期为14 d，STMR为0.510 mg/kg，残留最大值为1.740 mg/kg，戊唑醇的风险商为20.5%，在可接受范围内，不会对我国不同年龄段人群的健康产生不可接受的风险。根据膳食摄入风险评估结果，按照《食品中农药最大残留限量制定指南》推荐戊唑醇在猕猴桃中的最大残留限量为5 mg/kg。