胶体金免疫层析技术应用于农药残留检测的研究进展

罗俊霞张 刚申战宾杨 华叶 茂 段鹿梅李艳珍赵建波桑丽雅马 蕾张 威

（1.郑州市农产品质量检测流通中心，郑州 450006；2.河南恒晟检测技术有限公司，河南新郑 451100；3.杭州南开日新生物技术有限公司，杭州 311258；4.开封市农产品质量安全检测中心，河南开封 475000；5.郑州市农业技术推广中心，郑州 450002）

自2001年原农业部以蔬菜中高毒农药残留超标问题等为切入点在全国范围内开展无公害食品行动计划以来，关于农药残留检测方法的研究成为农产品质量安全检测监管工作的热点。目前，农药残留的检测手段有很多，如既能定量又能定性的仪器检测方法（色谱、色质联用、光谱等），非定量、非定性的检测方法（酶抑制法）[1]，（半）定量的检测方法（免疫分析方法）[2]等。胶体金免疫层析技术（Immunochromatography assay，ICA）是以胶体金为示踪标记物，应用于特异性抗原抗体反应的一种新型免疫标记分析技术[3]。在“十五”“十一五”期间，胶体金免疫层析技术在农药残留检测方面的研究因获得国家重大科技专项和国家科技支撑计划[4～5]支持而得到了长足的发展。但是目前我国农药残留的胶体金快速检测方法还未普及，迄今为止我国颁布的相关标准只有江苏省地方标准DB32/T 3170—2017、DB32/T 3365—2018和团体标准T/FSAS8—2017、T/CATCM 010—2019。胶体金免疫层析技术在农药残留检测中的开发与研究主要体现在新烟碱类、有机磷类、拟除虫菊酯类、有机氯类和氨基甲酸酯类杀虫剂，以及酰胺类、取代苯类杀菌剂和除草剂等方面[5～6]。本文在充分梳理大量文献研究成果的基础上，阐述了胶体金快速检测方法的特点，归纳总结了胶体金及其标记物的制备、胶体金免疫层析试纸条的组装、应用及评价等，并探讨了ICA的局限性及未来发展。

一、胶体金快速检测方法的特点

胶体金属于多相不均匀体系，是由氯金酸在柠檬酸三钠等还原剂的作用下聚合成特定大小金颗粒，并在静电作用下形成一种稳定的、疏水性金溶胶[6～7]。胶体金粒径一般在1～150 nm[7～8]，具有较大比表面积和良好的表面效应以及独特的光学、导电、导热等物理特性及生物相容性，其小尺寸效应和宏观量子隧道效应明显[3]；受表面等离子体共振效应影响，胶体金颜色随其粒径大小不同呈现为桔红色、红色、紫红色，一般粒径越大颜色越深[9]；在适当pH条件下，胶体金可与引入的外源蛋白质、核酸等发生特异性结合[9～10]，制备成特定的胶体金标记物；胶体金粒径的大小及分散性影响其应用范围和检测结果的准确度[11]。胶体金免疫层析技术是利用胶体金自身的显色特点结合免疫层析技术来诊断特异性的待测物。源于此项技术的胶体金快速检测卡、试纸条、试剂盒等，具有体积小、易携带、可即时检测、便捷高效的优势，其检测结果可肉眼直观实现残留定性判定、可和胶体金读数仪结合[12～13]实现残留定量或半定量检测[6]；其检测限低、灵敏度高，基本可以满足GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》的需要，也可满足基层快速检测残留物的需求[14]。

二、胶体金和胶体金标记物的制备

（一）胶体金的制备和保存胶体金的制备原理是将适量还原剂加入一定浓度的氯金酸溶液中，使金离子发生还原反应得到金原子，改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例可得到不同粒径的金颗粒[3]。制备胶体金的常用方法是化学还原法[15]，主要的还原剂有柠檬酸三钠、硼氢化钠、鞣酸、枸橼酸钠、白磷、抗坏血酸，其中柠檬酸三钠应用较为广泛[3，8]。有研究表明，使用抗坏血酸作还原剂制备的胶体金易发生聚沉现象，其不稳定性随抗坏血酸量的增加而增加；使用柠檬酸三钠作还原剂制备的胶体金从外观、吸收峰、颗粒大小等方面均符合后续胶体金标记试验的要求[15]。杨玉新等[16]分别以柠檬酸三钠、鞣酸、抗坏血酸、硼氢化钠为还原剂制备出单分散性好且粒径在5～20 nm之间的胶体金样品； 田宇等[10]、 楼小华等[17]、 肖琛等[18]、 孙晶等[19]均用柠檬酸三钠还原氯金酸；王菡等[20]用鞣酸—柠檬酸三钠还原氯金酸得到金溶胶；房立[9]采用柠檬酸三钠还原法和硼氢化钠还原法进行胶体金的制备，分别得到粒径为17、6.56 nm，大小均匀的胶体金。WANG和OUYANG[21]采用鲁米诺还原法制备了新型的双信号输出AuNPs探针，鲁米诺还原法在制备胶体金中不常使用。

在胶体金制备过程的每一个步骤均将胶体金用0.22μm滤膜过滤，可提高颗粒均一性和溶液稳定性，延长胶体金的保存时间[22]。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液以0.01%氯金酸+2 mL 1%柠檬酸三钠为最佳配比[22～23]，将溶液pH调至7，加热至18 min时可以得到粒径均匀、大小约为13 nm、溶液呈透明酒红色的胶体金[23]；曹涤非等[24]认为0.01%氯金酸+1.6 mL 1%柠檬酸三钠、保持沸腾时间10 min为最佳反应条件；周引怡[25]认为0.01%氯金酸+3 mL 1%柠檬酸三钠还原所形成的胶体金性质最稳定，适宜后续试验。胶体金在常规保存过程中会有细菌生长或者凝集颗粒形成，分装保存过程中加入少许防腐剂（0.02%NaN3）可有利于延长保质期，采用4 000 g低温离心可去除凝集颗粒[22]；贮存的温度条件发生变化对胶体金稳定性有影响，在4℃条件下贮存的胶体金最稳定[15～16，23]。

（二）胶体金标记物的制备胶体金标记物的制备是蛋白质、核酸等生物大分子被吸附到金颗粒表面的过程，影响该过程的因素有很多，如胶体金制备过程中所使用玻璃器皿的洁净程度、金颗粒的大小、胶体金的制备方法及稳定性、电解质、标记物的使用量、溶液pH等。在胶体金的制备过程中分别将洁净的玻璃器皿进行硅烷化处理，用铬酸洗液+双蒸水、王水浸泡过夜效果较好[9，18，26]；粒径3～30 nm的金颗粒作为免疫标记探针，方便胶体金标记物的制备[22]；柠檬酸三钠和抗坏血酸为还原剂制备的胶体金溶液对牛血清白蛋白的标记量较为适中[16]；以17.5 nm左右粒径的胶体金标记克百威多克隆抗体的显色效果较好[27]。

胶体金标记技术应用于农药残留检测方面，多数研究是根据靶标的不同，获得相应单克隆抗体或者多克隆抗体进行胶体金标记。很多学者在进行胶体金标记物制备时对标记物的浓度或用量、胶体金溶液的pH等方面进行了优化，给出了进行胶体金标记时各物质的最佳使用量（见表1）。近年来，采用农药抗体和DNA/RNA的生物条形码同时标记胶体金的生物技术兴起，也有采用核酸适配体进行胶体金标记的报道。陈鸽[34]用抗坏血酸还原法合成纳米酶Au@Pt颗粒，把DNA链及其互补链分别标记到胶体金和纳米酶Au@Pt颗粒上，制备了胶体金探针和纳米酶Au@Pt探针，建立了Au@Pt催化的生物条形码免疫分析方法；杜鹏飞[41]用三唑磷抗体、巯基修饰DNA捕捉链，互补生物条形码DNA修饰15 nm的胶体金（采用柠檬酸盐还原法合成），将三唑磷半抗原与卵清蛋白偶联修饰磁性颗粒形成磁性探针，建立了竞争型免疫化学反应体系，实现了对三唑磷的定量检测；张秀苑[42]将胶体金颗粒用三唑磷农药的单克隆抗体和DNA单链进行标记，制备了胶体金纳米探针，建立了基于DNA/RNA杂交的三唑磷农药生物条形码免疫分析方法，并建立了同时检测三唑磷、对硫磷、毒死蜱3种有机磷农药的多残留免疫分析方法。龚航[37]优化了吡虫啉单克隆抗体和三唑磷单克隆抗体标记胶体金条件，设计了一种基于三唑磷最大残留限量的多检测线免疫层析试纸条，在一定的范围内实现了对三唑磷的定量。万积成等[43]用百菌清合成抗原未能获得高效的针对百菌清小分子的单克隆抗体，用毒死蜱合成免疫原进行免疫，却获得针对百菌清小分子的高效单抗；用百菌清合成免疫原包被在硝酸纤维素膜（NC膜）上，与毒死蜱免疫株N5BC23F8C10抗体标记胶体金，或毒死蜱合成免疫原包被在NC膜上，与毒死蜱免疫株N5BC31F1C1抗体标记胶体金，两个配对均有较好的亲和力，且与百菌清半抗原均具有良好的竞争作用，得到了百菌清胶体金免疫竞争法试纸产品。万积成等认为该错位是由于机体内T细胞抗原表位的错综复杂的识别认定造成的，这种错误认定同百菌清和毒死蜱半抗原具有一定的相似性有密切关系。

表1 胶体金标记物制备过程中各种条件的优化

三、胶体金免疫层析试纸条的组装

（一）免疫层析试纸条的结构和检测原理免疫层析试纸条由样品垫、结合垫、NC膜、检测线（T线）、质控线（C线）、吸水垫和PVC底板组成（见图1）。免疫层析试纸条所遵循的检测原理有两种，竞争法和夹心法[6]。竞争法一般用于对小分子物质的检测，先用特异性抗原包被T线，将标记物与生物抗体标记的复合物喷涂在结合垫上，再用第二抗体包被C线，当样本中含有足够的靶标物时，C线显色，反之，则T线和C线均显色。夹心法一般用于对大分子物质的检测，即用单抗标记的探针分别包被T线和C线，当样本中含有足够的待测物时，T线和C线均显色，反之则只有C线显色。

图1 免疫层析试纸条结构

（二）组装胶体金试纸条材料的选择和处理

1.NC膜的选择。NC膜既是固定抗原、抗体的载体，也是样品和金标抗体的层析载体，还是进行免疫反应的部位，因此，选择合适孔径和层析速率的NC膜非常重要[8]。毛黎娟[27]取美国Millipore公司的HF24004和HF18002、德国S&S公司的AE98FAST和PRIMA85、印度mdi公司的150CNPH—SS40和CNPC—SS12 NC膜，应用已经选择好粒径的胶体金制作成试纸条，在阴性对照和0.089、0.89和8.9μg/mL的样品中对其进行比较，发现在阴性样品中PRIMA85膜的检测线颜色较浅且不易分辨，其他几种膜的检测线颜色均较深且灵敏度较接近，均可以使用。杨琳芬等[28]以点样方式将适当稀释后的包被原和羊抗鼠IgG包被在Millipore 90、Millipore 135和INDIA 70 3种NC膜上，经干燥、组装试纸条后进行PBS阴性试验，发现3种NC膜层析5 min均能显色，但显色程度不同，Millipore 135试剂层析速度慢，层析过程中溶液较为均匀，T线显色深且下缘清晰，显色效果比较理想；INDIA 70显色深度次之，但试剂层析速度太快导致反应不够充分，使金标抗体部分流失，影响显色效果；Millipore 90试剂层析速度居中，但显色深度较浅，因此认为Millipore 135作为NC膜最佳。刘莹[30]也认为在Millipore 135、Whatman AE 99、Sartorius CN 140、Whatman Immunopore RP、Whatman Purabind R 5种NC膜中，Millipore 135层析速度快且层析后膜上无背景残留，显色清晰均匀，效果最佳。常用于农药检测的层析试纸条组装的NC膜有美国Millipore135、Pall Vivid 90和Vivid 170及德国Sartorius140等[44]，其中应用较多的是Millipore和Sartorius[45～47]。

2.样品垫和结合垫的选择。毛黎娟[27]取德国S&S公司的Glass33、美国Millipore公司和ARIST公司的玻璃纤维膜为结合垫，经相同的条件处理后，分别和ARIST、S&S2992、S&S903和Millipore公司的样品垫组合制作成试纸条，对样品垫和结合垫进行选择，发现用ARIST公司的结合垫和样品垫组合制作的试纸条释放胶体金速度较快、在NC膜上未见到残留的胶体金，显色效果较好，适合选用。杨琳芬等[28]采用在金标垫处滴加2μL 10%的金标抗体，在样品垫处滴加70μL经前处理的空白苹果样品液的方法，对组装试纸条的QXLM、WFB、BX—SB06 3种样品垫进行了比较，发现QXLM对样本的吸收能力较WFB和BX—SB06强，但WFB的显色最深，说明WFB的过滤吸收效果足以满足对样品的吸收要求，而BX—SB06的吸收过滤效果有限，QXLM的吸收能力过强，对样本量的要求更大且显色较浅，因此认为WFB作为样品垫比较理想。刘莹[30]认为，在Ahistrom 8964、GF08、SB08、FB50、SB06 5种玻璃纤维膜为样品垫组装的胶体金试纸条中，Ahistrom 8964和GF08的综合性能较好，适合选用。

3.对样品垫和结合垫的处理。在胶体金层析试纸条的开发和研制过程中，为了提高试纸条的质量，减少假阳性和假阴性检测结果的发生，需要采用适宜浓度和酸碱度的磷酸盐缓冲液（PBS）对样品垫和结合垫进行浸泡处理。组装试纸条时，有学者将样品垫置于含0.3%BSA的0.05 mol/L磷酸缓冲液（PB，pH 7.2）中浸泡30 s，37℃干燥4 h后使用[17]，还有学者是将样品垫置于含0.15 mmol/L NaCl和0.25%曲拉通的50 mmol/L Tris—HCl缓冲液（pH 8.0）中浸泡2 h后烘干使用[26]。在pH均为7.4且均含有等量的BSA、NaN3、聚乙烯吡咯烷酮（PVP—K30）、蔗糖、非离子表面活性剂曲拉通X—100（Triton X—100）、聚山梨酯20（Tween—20）的PB和PBS中，PB体系在显色时间、显色条带的颜色深浅方面均优于PBS体系[18]。有学者试验得出添加15%蔗糖、1%BSA、0.1%Tween—20、0.1%叠氮钠的0.01mol/L PBS是金标抗体稀释液最佳配方[30]；从样本释放的速度和均匀性、样本的层析速度、胶体金的显色情况等方面看，含有0.5%BSA和0.05%Triton X—100的PB体系适合对结合垫进行预处理[40]。缓冲盐溶液中加入蛋白（如BSA）和表面活性剂（如曲拉通、Tween），通过层析分别可以封闭NC膜的蛋白结合位点和增强NC膜表面活性，且后者利于样品层析[8]，还可以降低封闭液的离子强度，从而使胶体金的溶解和泳动速度更快，且NC膜没有其他的背景色[18]；加入大分子聚合物（PVP等）可同时封闭大分子和蛋白结合位点[8]；加入蔗糖，可使胶体金的溶解和释放速度明显加快[18]。

四、胶体金免疫层析产品的应用

（一）胶体金免疫层析产品的适用范围本文将相关文献研制的胶体金免疫层析产品（试纸条、检测卡）适用范围进行了整理汇总（见表2）。如表2所示，基于免疫层析技术的胶体金免疫层析产品以单残留检测居多。多数胶体金免疫层析产品在研制的过程中不仅对其检测限、特异性进行了验证，同时选取一定的样品基质进行了检测，均取得较优的检测效果。但有一些试纸条或许是因为基质效应的问题，有一定的适用范围，不能用于所有的样品检测，如毛黎娟[27]研制的用于检测克百威残留的胶体金免疫层析试纸条，经过测试可以用于检测水、青菜、梨样品，不能用于茶叶样品的检测。另外，胶体金免疫层析产品对农药的检测限和对样品的检测限不同，邢丽杰等[39]研制的甲基对硫磷检测卡直接检测该农药，检测限是10μg/kg；而检测蔬菜样品中该农药，其检测限是50μg/kg。

表2 胶体金免疫层析产品的适用范围

（二）胶体金免疫层析产品的验证和应用周嘉明等[29]以新鲜茶叶为样品，对其研制的三氯杀螨醇胶体金免疫快速检测试纸条进行了验证，认为试纸条特异性和重复性均较好，但是存在一定的假阳性率。陈美莲等[48]利用深圳市易瑞生物技术股份有限公司生产的多菌灵、吡虫啉和啶虫脒试纸条，分别选择GB 2763—2021中明确农药残留限量的蔬菜品种和市面上常见的蔬菜（共9种）作为样品基质，在不同的浓度水平下（0、1/2限量值或产品检出限、限量值、2倍限量值）制备阳性加标样品，用试纸条对阳性加标样品和实际样品进行测定，只有啶虫脒试剂条在0.1 mg/kg浓度水平下出现了2例假阳性；该团队还选择哒螨灵、咪鲜胺、嘧霉胺、嘧菌环胺、克百威、毒死蜱、阿苯达唑、甲氰菊酯、溴氰菊酯、百菌清、腐霉利、烯酰吗啉共12种农药，对3种试纸条开展交叉反应试验，发现阿苯达唑与多菌灵试纸条的交叉反应率为100%。万积成团队[43，49～51]、 崔新仪等[52]、 袁宝凤等[53]分 别 采 用 万华（普曼）生物工程有限公司研制的百菌清、毒死蜱、霜霉威、甲霜灵、吡虫啉等试纸条，对在各试纸条设定的检测限、2倍检测限等水平下制备的黄瓜、番茄等阳性样品进行测定，同色谱法的测定结果进行比对，符合率较高，认为适宜推广使用；邓家军等[54]采用圆白菜、苹果等样品对北京勤邦生物技术有限公司生产的腈菌唑、三唑磷、水胺硫磷、氟虫腈、百菌清5种农药胶体金快速检测试纸条进行验证，认为该产品稳定性好、灵敏度高、无假阳性和假阴性现象，相对准确度高；叶秋雄等[55]采用空白基质加标方式对市售的14个品种的胶体金快速检测卡进行特异性、准确性（假阳性率、假阴性率）等指标验证，结果表明，14个产品的特异性均较好，但有3个产品的假阳性率或假阴性率较高。

五、胶体金免疫层析产品的评价

（一）高效的前处理方法是决定胶体金免疫层析产品实用性的关键胶体金免疫层析试纸条（检测卡）作为一种农药残留的检测手段，具有制作方便、价格低廉、容易操作、无放射性污染等优点[3]，其质量优劣决定其检测结果的准确性，而对其质量优劣的评价指标有很多，如灵敏度、准确度、特异性、重现性、稳定性及基质效应等[1]。高效的前处理方法是快速分析检测的关键[56]，快速检测产品是否可以满足现场实时监测的需求和前处理步骤的简便与否紧密相关，在利用胶体金免疫层析产品进行检测时，在前处理过程中都需要借助一定的仪器对样品进行处理。姚帮本等[26]对韭菜等样品进行测试时，取一定量使用粉碎机充分粉碎后的样品于离心管中，在一定转速下离心几分钟，取上清液直接用于检测；万积成团队[43，49～51]研制的快速检测卡检测蔬菜样品时，将样品进行榨汁处理后加入15%的NaCl（果菜类的样品直接榨汁，叶菜类样品添加等量水进行榨汁），静置后用于检测；袁宝凤等[53]、施诚愿和张俊聪[57]所使用的胶体金免疫层析检测卡的前处理方法均是直接采用蔬菜的汁液进行滴卡测定。如果胶体金快速检测卡用于检测肉类样品中的农药残留，则要考虑此类样品的复杂成分，在前处理过程中要使用有机溶剂进行待检成分的提取，同时还要对样品进行脱脂处理[19]。周嘉明等[29]在使用三氯杀螨醇胶体金快速检测试纸条对新鲜茶叶进行检测时，前处理过程未对样品进行粉碎，但引入了有机溶剂乙腈进行振荡、离心，对待检成分进行提取，之后氮吹，再将复溶液进行溶解后进行检测。

（二）检测结果的判定决定胶体金免疫层析产品检测的准确度胶体金免疫层析产品的检测结果判定是通过肉眼直观判断，存在模糊判定及个人视觉差异[19]，对同一试纸条或者检测卡，其检测结果的判定在检测人员之间势必存在一定的误差[58]，造成检测结果的准确度降低。因此建议在使用此类产品进行农药残留的检测时，结合胶体金读数仪进行结果判定，这样会大大提高其检测结果的准确度。另外，由于农产品种类繁多，基质复杂，一些复杂基质样品中的共提物会对免疫层析过程中抗原、抗体的结合产生干扰，影响判定结果的准确性[6]。

六、总结与展望

（一）胶体金免疫层析产品的局限性胶体金免疫层析产品在实际检测工作中有一定的局限性，高特异性的单残留胶体金免疫层析产品往往只能检测一种靶标物质，在实际工作中倾向用于已知施药情况的果蔬类产品的生产基地，在果蔬产品上市前对特定的物质进行检测[59]；而基于胶体金免疫层析法的多残留检测均建立在单一检测线的多残留检测，此类快速检测产品无法准确定性、定量，且仅仅局限于对几种农药的检测，适合批发市场、超市等机构用于对样品的初筛。

（二）多残留检测卡（试纸条）的定性和单残留检测卡（试纸条）的定量传统的具有一条检测线的胶体金免疫层析产品，只可以定性检测样品中一种农药，或者对样品中的某种农药进行半定量，对样品中高于最低检出限的农药无法进行定量。为了扩大胶体金免疫层析产品的检测范围和定量精度，在不使用胶体金读数仪的情况下，将多条单一颜色的检测线组合在同一层析膜上是提高此类产品检测能力的最直接方法[2]。多检测线的胶体金免疫层析产品同传统的单条检测线的产品相比，可以实现多残留的准确定性[60]或者单残留的半定量[61]，具有提供更多的参考信息和节省检测时间等优点。但是检测线离样品垫越远，样品溶液层析到该线所需时间就越长，同时多条检测线间往往存在难以预估的干扰，因此通过在单个层析膜上添加更多的检测线来扩展检测农药种类的方法欠佳[2]。另外，多检测线的免疫层析产品的研制不仅要考虑特异性、稳定性等常规评价指标，还要优化选择各种材质，考虑检测线之间的间距、检测时样品浸提液的使用量和样品层析速度，使线条显示清晰、均匀，达到检测结果准确、可靠的目的。

免疫分析技术是基于抗体与抗原或半抗原之间的特异性识别反应而建立的一种生物化学分析方法[2]，很多学者认为这种方法简单、快速、灵敏且检测产品携带方便，是现场即时筛查的一种理想手段[62～64]。但依前文所述，快速检测卡（试纸条）尽管优点居多，但实现快速呈现其结果是基于对样品进行一定的前处理，最简单的前处理方法也需要使用粉碎机对样品粉碎取得样品汁液，检测复杂样品则前处理更加复杂，因此其使用起来的便捷仅仅建立在对农药的测定环节。另外这种检测卡（试纸条）多是单残留的检测卡（试纸条），对未知靶标的样品进行检测需要购置多种检测卡（试纸条），这无疑增加了检测成本。如果未来有高通量检测卡（试纸条）问世，将会大大幅降低检测成本。