食品中志贺氏菌属的测定能力验证结果分析

◎ 王丽杰，何丽萍，杨晓晖，张明新

(河南中测技术检测服务有限公司，河南 郑州 450000）

志贺氏菌，又称痢疾杆菌，为革兰氏阴性杆菌，也是人类细菌性痢疾最常见的病原菌[1]。它不但可以通过食物和水源传播、也可通过粪口传播和接触传播，是重要的食源性致病菌之一。据调查，全球每年约有1.6亿人感染志贺氏菌，大约有110万人死亡，其中绝大多数是儿童[2]。在发达国家，最常见的是宋内氏志贺氏菌和痢疾志贺氏菌[3-4]，志贺氏菌在我国分布广泛，其中以福氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌最为常见。志贺氏菌能够污染包括蔬菜、肉类、蛋制品和奶制品在内的很多食物，它能分泌内、外毒素，以较低的感染剂量使疾病得到有效的传播，可引起腹痛、腹泻、里急后重、结肠水肿和溃疡等症状[5-6]。

目前，志贺氏菌的检测有传统的检测方法，如国家标准法[7]、免疫学检测方法等。常规的国标方法检验志贺氏菌，在增菌和选择性培养后，再用生化试剂鉴定和血清学分型，往往需要数天的时间来得到检测结果[8]。随着分子生物学的发展，恒温扩增荧光技术因仪器简单、操作简单、使用便捷、特异性高和快速判读等特点，被广泛应用于微生物检测中。

能力验证是利用实验室间比对，按照预先制订的准则评价参加者的能力。当有的量值溯源尚难实现或无法实现时，可利用能力验证来表明测量结果的可信性。为监督评估本检测机构人员检测志贺氏菌属的能力，提高检测质量，故参加志贺氏菌属定性检测的能力验证。

1 材料与方法

1.1 样品和标准菌株

志贺氏菌属能力验证检测样品3个，编号为CFAPA-1192-101、CFAPA-1192-446和CFAPA-1192-068，均为西林瓶真空密封包装的白色粉状样品。标记为M1、M2、M3。本次能力验证，由大连中食国实检测技术有限公司组织实施。福氏志贺氏菌标准菌株（CMCC（B）51572）作为阳性对照菌株。

1.2 培养基及试剂

志贺氏菌增菌肉汤、志贺氏菌显色培养基、营养琼脂（NA）、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD）、麦康凯琼脂（MAC）、三糖铁琼脂（TSI）、Kovacs氏靛基质试剂盒（Kovacs’s indole kit）、HBI志贺氏菌生化鉴定条、血清和志贺氏菌核酸检测试剂盒（恒温荧光法）。

1.3 仪器与设备

YXQ-70A立式压力蒸汽灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；BSC-1500IIA2-X生物安全柜（济南鑫贝西生物）；SPX-250B-Z生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；7L厌氧盒（日本三菱）；Deaou-308C恒温扩增荧光检测系统（广州迪澳生物科技有限公司）。

1.4 检测方法

按照国家检测标准GB 4789.5—2012检测步骤对能力验证样品进行检测，同时用恒温扩增荧光法作为辅助检测方法，进行结果比对。对筛选出疑似菌落，采用恒温扩增荧光法进行鉴定。同时以福氏志贺氏菌标准菌株（CMCC(B)51572）为阳性对照用菌。

1.4.1 GB 4789.5—2012方法检测

（1）水化与预增菌。按照组织单位给定参试指导书再水化能力验证样品，参照国家标准GB 4789.5—2012，将上述检样转移至盛有225 mL志贺氏菌增菌肉汤的无菌均质袋中，拍打混匀，于41.5 ℃厌氧培养16～20 h。同法操作将标准菌株接种培养。

（2）分离。各取一环增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于XLD平板、志贺氏菌显色培养基平板、MAC平板上，于36 ℃培养20～48 h，观察各平板菌落生长形态。

（3）初步生化试验。自上述平板上分别挑取3个典型及可疑菌落，分别接种TSI、半固体各一管，由于营养琼脂无选择性，可将挑取可疑菌落同时接种至志贺氏菌显色平板和营养琼脂平板上，增加选择效果，置（36±1）℃培养箱培养20～24h，观察培养结果。凡是TSI斜面产碱、底层产酸、不产硫化氢、不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体）及半固体管中无动力的菌株，挑取上述志贺氏菌显色平皿纯培养生长的菌苔，进行生化鉴定试验和血清学试验。

1.4.2 恒温扩增荧光法

（1）制备DNA模板。增菌液DNA模板制备方法为取1.4.1中志贺氏增菌液1 mL置于1.5 mL无菌离心管中，12 000 r·min-1离心 2 min，弃上清液，加入 100 μL DNA提取液，混匀后将离心管放置于水浴锅中，100 ℃加热5 min，然后12 000 r·min-1离心2 min，取上清液作为DNA模板。单菌落DNA模板制备方法为在无菌PCR管中加入20 μL无菌水，后用无菌枪头挑取1.4.1中NA平板上纯培养的单菌落于PCR管中，用移液枪吹打，重悬混匀，然后置于PCR仪中，执行PCR程序95 ℃，10 min，待程序结束后取出，12 000 r·min-1离心2 min，取上清液作为反应模板。

（2）恒温扩增荧光法反应条件。参照志贺氏菌核酸检测试剂盒（恒温荧光法）的说明进行，具体操作步骤为在检测界面分别点击“请编写试验名称”“项目名称”完成编辑，编辑完后选取“反应时间”为45 min；将上述反应管放入仪器内，点击“开始检测”开始反应。

2 结果与分析

2.1 GB 4789.5—2012检测结果

2.1.1 菌落形态特征

按照GB 4789.5—2012操作，分别取1环培养后的志贺氏菌增菌肉汤划线接种于XLD平板、志贺氏菌显色平板和MAC平板，培养后菌落形态特征如表1所示。结果表明，XLD干扰菌的菌落为黄色和无色有黑色中心菌落；MAC干扰菌的菌落为粉色菌落，与典型菌落特征容易区分；志贺氏菌显色培养基干扰菌的菌落为绿色、黑色、无色有黑色中心菌落。

表1 选择性分离平板上的菌落特征表

2.1.2 初步生化鉴定结果

观察样品及标准菌株在XLD、志贺氏菌显色平板、MAC上的菌落形态特征，分别挑取3个可疑菌落在TSI斜面划线后垂直穿刺，因生化鉴定试剂条配置斜面较小，生化现象易被掩盖，所以TSI最好采用机构自己配置的高层斜面，接种针挑取分离后菌落，于斜面上划线，再穿刺（穿刺针不要破壁，不要穿透，距底部5 mm左右即可），置于36 ℃培养箱培养20～24 h后，观察实验现象。同时挑取同一菌落划线于志贺氏显色平板与营养琼脂平板进行纯化，培养后挑取适量菌体，制备成0.5麦氏比浊的菌悬液，用HBI志贺氏菌生化鉴定条进行鉴定。样品M1、M2、M3各挑选3个可疑菌落，标准菌株挑选1个，鉴定结果见表2。

表2 初步生化实验、生化鉴定试剂条鉴定结果表

结 果 表 明 M1-1、M1-2、M1-3、M3-1、M3-2、M3-3在TSI斜面产酸、底层产酸、不产硫化氢以及产气，初步判断为非志贺氏菌属。M2-1、M2-2、M2-3在TSI斜面产碱、底层产酸、不产硫化氢以及不产气，初步判断为可疑志贺氏菌属。

2.1.3 生化鉴定试剂条鉴定结果

采用HBI志贺氏菌生化鉴定条对样品M1、M2、M3的可疑菌落进行鉴定，结果见表2。TSI、半固体初步生化实验及HBI志贺氏菌生化鉴定条实验结果表明，样品M2中检出可疑性志贺氏菌属，M1、M3中未检出可疑志贺氏菌属。

2.1.4 血清学试验

按照GB 4789.5—2012操作，结果表明M2-1、M2-2、M2-3血清学凝集，其余血清学不凝集。根据2.1.3、2.1.4实验结果，得出样品M2中检出志贺氏菌，M1、M3未检出志贺氏菌。

2.2 恒温扩增荧光法鉴定

挑取样品在不同选择性平板上的可疑单菌落按照1.4.2进行检测。采用恒温扩增荧光法鉴定，结果显示M2以及标准菌株出现对数增长的S型曲线，表明志贺氏菌属阳性检出。M1、M3未出现荧光对数增长的S型曲线，表明志贺氏菌属阴性未检出。

3 结论

目前，GB 4789.5—2012是被检测机构经常采用的志贺氏菌检测方法，但根据志贺氏菌的生长及生化特性，国家标准检测方法需要经过厌氧预增菌培养、分离纯化、TSI半固体生化试验、生化鉴定试剂条或生化鉴定系统鉴定，检测完成需历经8 d时间，检测周期较长；而采用恒温扩增荧光法检测只需提供适宜的恒定温度，检测周期仅约20 h，简单、高效、特异性强、快速且操作简单。

能力验证样品M2在XLD及志贺氏显色培养基上均出现无色带黑色中心菌落，鉴定为沙门氏菌干扰菌落，如菌落形成较小时，菌落黑色中心未形成，容易误判为无色菌落，因此，在分离纯化时可挑取同一菌落同时分离划线于志贺氏显色平板及营养琼脂平板，在志贺氏显色平板上判定为纯菌落及形态后，再从营养琼脂上挑取菌落制备菌悬液。

实验现象表明，GB 4789.5—2012中选择性平板培养基上干扰菌的菌落形态特征与志贺氏菌的菌落形态特征相似，不易分辨，如果检测人员经验不足，容易造成漏筛，造成假阴性结果。另外，菌悬液制备不易把控，影响生化鉴定试验结果，易造成假阳性结果，导致检测结果判定错误，而恒温扩增荧光法依据扩增曲线走向进行检测结果的判定，不必选取可疑菌落，避免了漏筛或生化鉴定现象错判的可能性，提高结果测定的准确度和可靠性。

以上实验结果表明，本次检测机构参加的志贺氏菌属定性检测的能力验证结果为能力验证样品CFAPA-1192-446检出志贺氏菌，样品CFAPA-1192-101、CFAPA-1192-068未检出志贺氏菌，取得“满意”结果，验证了本检测机构志贺氏菌的检测能力，确保实验数据的准确性，为政府监督部门监督执法提供强有力技术支撑。恒温扩增荧光法与GB 4789.5—2012检测结果一致。恒温扩增荧光法因仪器简单、操作简单、使用便捷、特异性高和快速判读等特点，可作为志贺氏菌属检测验证中的比对方法，两种方法相互辅助验证，大大提高了检测结果的准确性。