超高效液相色谱-串联质谱内标法测定鸡肉中金刚烷胺残留量的不确定度评定

◎ 朱飞如，冯俊富，余开科，麦运佳，李 峰

(北海市食品药品检验所，广西 北海 536000)

金刚烷胺又名三环癸胺、金刚胺，属于三环胺类药物，1960年首次人工合成[1]。经查阅文献，金刚烷胺这种药物，最开始被用于抑制流感病毒，在1966年被国际上批准为预防药，1976年在预防药的基础上又确认为治疗药[2-3]。在畜牧养殖方面，金刚烷胺主要用在治疗和预防禽类流感，其容易引起副作用主要在两方面，一是精神异常，二是日益增加的耐药性，危害着消费者的身体健康，同时也对畜禽产品的安全监管带来极大挑战。我国农业部2017年印发兽药残留监控计划的通知中，第一个监控项目是金刚烷胺，由此看出控制金刚烷胺的重要性[4]。金刚烷胺抗病毒兽药使用，给消费者身体带来极大的危害。2005年10月农业部发布第560号公告，禁止金刚烷胺等抗病毒兽药的生产和使用[5]。

目前文献报道的测定金刚烷胺方法主要包括毛细管气相色谱法[6]、高效液相色谱-荧光检测法[7]和液质联用法[8]等。随着检测要求的提高，数据要求更加精准，以便加强监管，实验室控制数据质量的一个重要步骤是测量不确定度，它不单在科学上有着重要意义，在现实上也有重要意义[9]。在许多在仪器操作方面都有广泛的应用，如理化实验、仪器操作等[10-16]。本研究根据《化学分析测量不确定度评定》（JJF 1135—2005）[17]和《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[18]，对国标《食品安全国家标准动物性食品中金刚烷胺残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》[19]中超高效液相色谱-串联质谱内标法检测鸡肉中金刚烷胺残留量的不确定度进行评定，建立了鸡肉中金刚烷胺残留量的不确定度评定方法，推断出测量不确定度结果的主要来源和影响实验数据准确度的主要因素，为加强实验室质量控制提供更加科学、可信和准确的依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

金刚烷胺（99.05%，Stanford Chemicals）；D15-金刚烷胺（99.20%，Stanford Chemicals）；甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；正己烷（色谱纯，美国Merck公司）；冰乙酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；甲酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；无水硫酸钠（优级纯，天津市光复精细化工研究所）。

1290/6460 液相色谱-串联质谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；XA205DU电子天平（MAX 81g/220 g，d=0.01 mg/0.1 mg，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；本实验使用玻璃量器均是A级。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色 谱 柱：ZORBAX SB-C18（2.1 mm×150 mm，3.5 μm），流速：0.3 mL·min-1，柱温：30 ℃，进样量：10 μL；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：甲醇；梯度洗脱：0～1.5 min，维持10% B；1.5～2 min，10% B线性变化至90% B；2～5 min，维持90% B；5～5.1 min，90% B线性变化至10% B；5.1～10 min，维持10% B。

1.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾（ESI），正离子模式；扫描方式：多反应监测（Multiple reaction monitoring，MRM）；监测离子见表1。

表1 被测物的母离子和子离子参数表

1.2.3 标准工作溶液的制备

金刚烷胺标准储备液：精密称取标准品金刚烷胺0.010 20 g于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释定容至刻度，摇匀，即得；金刚烷胺标准中间液：精密量取金刚烷胺标准储备液1 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；金刚烷胺标准工作液A：精密量取金刚烷胺标准中间液1 mL于100 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；金刚烷胺标准工作液B：精密量取金刚烷胺标准工作液A 1 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；金刚烷胺标准工作液C：精密量取金刚烷胺标准工作液B 2 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；D15-金刚烷胺标准储备液：精密称取D15-金刚烷胺标准品0.000 90 g于1 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；D15-金刚烷胺标准中间液：精密量取D15-金刚烷胺标准储备液0.1 mL于100 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；D15-金刚烷胺标准工作液：精密量取D15-金刚烷胺标准中间液1 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

分别加入金刚烷胺标准工作液C 50 μL、100 μL，金刚烷胺标准工作液B 50 μL、100 μL，金刚烷胺标准工作液A 50 μL、100 μL，分别加入D15-金刚烷胺标准工作液100 μL，分别加入空白基质溶液350 μL、300 μL、350 μL、300 μL、350 μL 和300 μL，配制成标曲 1 ～ 6 浓度分别为 2.02 μg·L-1、4.04 μg·L-1、10.10 μg·L-1、20.21 μg·L-1、101.03 μg·L-1和 202.06 μg·L-1的标准系列溶液。

1.2.4 样品的处理

称取试料2 g，于50 mL离心管中，加D15-金刚烷胺标准工作液200 μL，加1%乙酸乙腈溶液10 mL，漩涡2 min，离心5 min（转速为3 000 r·min-1），上清液转入另一50 mL离心管中，重复提取一次，合并两次上清液，加无水硫酸钠3 g、正己烷10 mL，涡旋1 min，3 000 r·min-1离心5 min，弃去正己烷层，剩余溶液转至100 mL鸡心瓶中，40 ℃水浴下旋转蒸干，用1.0 mL甲醇溶解残渣。加入PSA 50 mg，涡旋30 s，取上清液过滤膜至1.5 mL试管中。量取滤液0.5 mL于离心管中，40 ℃氮气吹干，加入50%乙腈水溶液0.5 mL，涡旋 30 s，10 000 r·min-1离心 5 min，取上清液供上机测定。

1.2.5 空白溶液的制备

除未加样品外，其他操作参照“1.2.4”，制备空白溶液。

2 数学模型

鸡肉中金刚烷胺残留量的数学模型为：

式中：X-样品中金刚烷胺残留量，μg·kg-1；C-从标准曲线得到金刚烷胺的质量浓度，μg·L-1；V-溶解残渣的甲醇体积，mL；m-样品的质量，g。

3 不确定度来源分析

从检测过程和数学模型分析可知，影响鸡肉中金刚烷胺残留量的不确定度因素主要有：称量样品引入的不确定度urel(m)；溶解残渣的甲醇体积引入的不确定度urel(v)；配置标准曲线引入的不确定度urel(C)；标准曲线拟合引入的不确定度urel(I)；重复测量样品的不确定度urel(x)。

4 不确定度的评估

4.1 称量样品引入的不确定度urel(m)

使用万分之一电子天平，称取2.000 0 g试样，查阅其检定证书可知，当称样范围在0～50 g时，其最大允许误差为±0.000 5 g，按均匀分布则称量样品引入的标准不确定度为：

则称量样品的相对标准不确定度为：

4.2 溶解残渣的甲醇体积引入的不确定度urel(v)

4.2.1 移液器体积校准引入的不确定度u1(v)和u2(v)

溶解残渣的甲醇体积为1 mL，根据《移液器检定规程》（JJG 646—2006）[20]，用1 mL移液器移取1 mL的容量允差为±1.0%，测量重复性为0.5%，按均匀分布则移液器体积校准引入的相对标准不确定度为：

4.2.2 温度引入的标准不确定度u3(v)

实验室保持温度范围在（20±5）℃，甲醇的膨胀系数是1.19×10-3/℃，其按均匀分布则温度引入的相对标准不确定度是：

则溶解残渣的甲醇体积的相对标准不确定度为：

4.3 实验标准曲线配制引入的不确定度urel(C)

4.3.1 标准品引入的不确定度urel(C1)

查阅证书可知，标准品金刚烷胺含量为99.05%，不确定度为±1.0%；D15-金刚烷胺含量为99.20%，不确定度为±1.0%；当样品待测液和标准系列溶液中内标物含量一致时，储备液配制、中间液配制、工作液配制和内标物的纯度等均不对样品中的目标物含量带来影响，故本文仅评估内标物加入体积引入的不确定度[21]。

则金刚烷胺引入的相对标准不确定度为：

4.3.2 标准品称量引入的不确定度urel(C2)

使用十万分之一电子天平，称取标准品金刚烷胺0.010 20 g，根据检定证书当称样范围在0～5 g时，其最大允许误差为±0.000 05 g，按均匀分布（则金刚烷胺标准品称量引入的标准不确定度为：

则金刚烷胺标准品称量的相对标准不确定度为：

4.3.3 标准储备液的配制引入的不确定度urel(C3)

标准储备液是将标准物质用甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中。

（1）玻璃量器体积校准引入的不确定度u1(C3)。查阅JJG 196—2006[22]可知，10 mL A级标准的容量瓶，容量允差为±0.020 mL，按均匀分布则玻璃量器体积校准引入的标准不确定度为：

（2）温度引入的标准不确定度u2(C3)。实验室保持温度范围（20±5）℃，甲醇的膨胀系数是1.19×10-3/℃，其按均匀分布则温度引入的标准不确定度为：

则标准储备液的配制引入的不确定度为：

标准储备液的配制引入的相对标准不确定度为：

4.3.4 标准中间液和标准工作液的配制引入的不确定度urel(C4)

标准中间液是标准储备液1 mL用甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中；标准工作液A是取标准中间液1 mL用甲醇溶解并定容于100 mL量瓶中；标准工作液B是取标准工作液A 1 mL用甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中；标准工作液C是取标准工作液B 2 mL用甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中。

根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）[22]，配置标准中间液和标准工作液引入的相对标准不确定度见表2。由表2可知，标准中间液和标准工作液的配制引入的不确定度urel(C4)为0.012 5。

表2 标准中间液和标准工作液引入的相对标准不确定度表

4.3.5 配制标准曲线过程引入的不确定度urel(C5)

由“1.2.3”标准系列溶液的配制可知，50 μL使用了3次，100 μL使用了9次，水的体积膨胀系数：2.1×10-4/℃，乙腈的体积膨胀系数：1.37×10-3/℃，则50%乙腈水的平均体积膨胀系数为3.95×10-4/℃，根据《移液器检定规程》（JJG 646—2006）[20]，配制标准曲线过程引入的相对标准不确定度见表3，由表3可知，配制标准曲线过程引入的不确定度urel(C5)为0.051 4。

表3 标准曲线配制过程引入的相对标准不确定度表

综上所述，配制标准曲线引入的不确定度urel(C)为

=0.053 4。

4.4 拟合标准曲线引入的不确定度urel(I)

取标曲1～6系列浓度各测定2次，横坐标为标准溶液浓度，纵坐标为标准溶液色谱峰面积与内标峰面积比值，做线性拟合而成的线性回归方程：I=bc+a（b为斜率，a为截距），测定数据及计算结果表4。

表4 标准曲线数据表

标准曲线变动性的标准差为：

式中：SR表示标准曲线的标准差；n表示标准曲线校准点测量次数；Ii表示测定的标准溶液色谱峰面积与内标峰面积比值；b表示校准曲线的斜率；ci表示标准溶液含量，μg·L-1，a表示校准曲线的截距。

用该曲线对样液重复测定6次，样液中含量平均值为82.03 μg·L-1，曲线拟合引入的标准不确定度为：

式中：SR表示标准曲线的标准差；n表示标准曲线校准点测量次数；p表示被测样品测定次数；b表示校准曲线的斜率；表示样液中含量平均值，mg·L-1；ci表示标准溶液含量，mg·L-1；

则曲线拟合引入的相对标准不确定度为：

4.5 样品重复测量的不确定度urel(x)

对样品重复测定6次的结果见表5。

表5 样品测定结果表

用贝塞尔公式计算样品重复测定的标准偏差为：

式中：s表示标准偏差；n表示测量次数；xi表示样品的测定值，单位μg·kg-1；X—表示n次测定的算术平均值，单位 μg·kg-1。

样品重复测定平均值的标准不确定度为：

样品重复测定平均值的相对标准不确定度为：

4.6 合成标准不确定度urel

鸡肉中金刚烷胺残留量的相对标准不确定度汇总见表6。

表6 金刚烷胺残留量不确定度分量总结表

则其合成相对标准不确定度为：

4.7 扩展不确定度的评定

合成标准不确定度：u=urel×x—=0.055 5×41.013=2.28 μg·kg-1，取扩展因子k=2（95% 置信率），则扩展不确定度：U=2u=2×2.28=4.56 μg·kg-1。金刚烷胺残留量的测定结果为：X=（41.01±4.56）μg·kg-1（k=2）。

5 结论

通过不确定度的分析可知，标准曲线制备和标准曲线拟合是测量鸡肉中金刚烷胺残留量不确定度的主要来源。对此，要注意实验过程中标准曲线的制备、标准曲线的拟合，这两个因素影响测定结果的准确度和可信度。使用精确度更高，经过严格检定的玻璃量器，或增加标准曲线的测定次数，严格规范实验操作各个步骤，配制浓度范围符合检测项目实测值的标准曲线等，可大大降低测定结果的不确定度，多举措、多方位提高实验结果的可信度。