2DLC-MS/MS法测定人尿液中多环芳烃暴露生物标志物

王天南，陈 敏，汪阳忠，李 钢，费 婷，吴 达，陆 捷

上海烟草集团有限责任公司技术中心，上海市浦东新区秀浦路3733号 201315

多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一类重要的环境致癌化合物，被美国环境保护署（The United States Environmental Protection Agency）列为优先控制污染物［1-2］。人体PAHs暴露途径主要有吸入和摄入两大类［3］，卷烟抽吸过程中的不完全燃烧会产生PAHs，为吸烟者带来暴露风险［4-7］。PAHs进入人体后会代谢生成多种羟基多环芳烃化合物（Monohydroxylated polycyclic aromatic hydrocarbons,OHPAHs）并随尿液排出［3］。尿液中OHPAHs的浓度是评价多环芳烃暴露水平的重要指标［8］；其浓度通常在ng/L~μg/L水平，量极低且基质干扰严重，检测难度大。目前常用的分析方法有气相色谱-质谱联用（GC-MS）［9-10］、高效液相色谱-荧光 检 测（HPLC-FD）［11］和 液 相 色 谱-串 联 质 谱（LC-MS/MS）［12-19］法等。GC-MS法需要衍生化处理，过程繁琐、耗时长。HPLC-FD法通常用来检测尿液中浓度较高的羟基芘，难以满足其他低浓度OHPAHs的分析需求。目前，文献中报道以LC-MS/MS法为主，该方法灵敏度高、稳定性好，且不需要对样品进行衍生化处理，能够满足痕量OHPAHs的检测需求。但是由于OHPAHs的浓度低、干扰成分多，该方法需要采用液液萃取［13］、固相萃取［14］或搅拌棒吸附萃取［15］等前处理方法对目标物进行富集浓缩并降低杂质的干扰，常需要酶解、多步液液萃取、SPE小柱净化、吹干、复溶等复杂的样品前处理步骤，操作繁琐且耗时长。

因此，采用二维液相色谱-串联质谱（2DLC-MS/MS）技术［20-21］，建立了尿液10种PAHs暴露生物标志物的新方法。该方法前处理简单，样品经酶解过滤后直接上机，无需萃取浓缩，目标物经一维色谱分离除杂、捕集柱富集浓缩及二维色谱梯度洗脱，实现了5种羟基菲同分异构体的基线分离，可成功应用于吸烟者和非吸烟者的尿液分析。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

采集6名吸烟者和6名非吸烟者的晨尿，保存于-80℃冰箱中。

1-羟基萘（1-OHNap）、2-羟基萘（2-OHNap）、2-羟基芴（2-OHFlu）、3-羟基芴（3-OHFlu）、1-羟基菲（1-OHPhe）、2-羟基菲（2-OHPhe）、3-羟基菲（3-OHPhe）、4-羟 基 菲（4-OHPhe）、9-羟 基 菲（9-OHPhe）、1-羟基芘（1-OHPyr）、2-羟基萘-d7（2-OHNap-d7）、13C6-3-羟 基 芴（13C6-3-OHFlu）、13C6-3-羟 基 菲（13C6-3-OHPhe）、1-羟 基 芘-d9（1-OHPyr-d9）（美国Cambridge Isotope Laboratories公司）；β-葡萄糖醛酸酶（美国Sigma公司）；乙腈、甲醇（AR，美国Tedia公司）；乙酸、乙酸铵（AR，国药集团化学试剂有限公司）；人工尿液（东莞创峰科技有限公司）。

1290液相色谱仪（配DAD检测器）、6495三重四极杆质谱仪（配备喷射流技术电喷雾离子源，AJS-ESI）、二元泵、六通阀、Eclipse PAH色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8μm）、Eclipse PAH色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8μm）（美国Agilent公司）；Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm，美国Waters公司）；LC-20AD单元泵（日本岛津公司）；Eppendorf 5810R高速离心机（德国Eppendorf公司）；Milli-Q纯水仪（美国Millpore公司）；FiveEasy Plus型pH计（瑞士Mettler Toledo仪器公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

标准储备液：用甲醇作溶剂，配制1-/2-OHNap的浓度均为5μg/mL、其余8种目标物的浓度均为1 μg/mL的标准储备液。

内标溶液：用甲醇作溶剂，配制2-OHNap-d7和1-OHPyr-d9的浓度均为10μg/mL、13C6-3-OHFlu和13C6-3-OHPhe的浓度均为5μg/mL的内标溶液。

系列混合标准工作溶液：用甲醇作溶剂，取标准储备液及内标溶液配制1-/2-OHNap的浓度分别为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0 ng/mL，其余8种目标物的浓度分别为0.2、1.0、2.0、10.0、20.0和100.0 ng/mL，2-OHNap-d7及1-OHPyr-d9的浓度均为50 ng/mL，13C6-3-OHFlu和13C6-3-OHPhe的浓度均为25 ng/mL的6级混合标准工作溶液。

1.2.2 样品前处理

将预先收集的尿液样品解冻至室温，取5 mL于15 mL离心管中，依次加入30μL内标溶液、1 mL乙酸铵-乙酸缓冲液（pH=4.02）和10µLβ-葡萄糖醛酸酶，混合均匀后放入恒温槽中，37℃下避光酶解16 h。样品经0.2μm的PTFE滤膜过滤后上机分析。分析条件：

A.一维液相色谱条件。色谱柱：Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；A相：水；B相：甲醇；进样量：20μL；流速：0~1.0 min 0.2 mL/min，16.0~26.0 min 0.1 mL/min，30.0 min 0.2 mL/min；梯度洗脱条件：0~5.0 min 5%B，15.0~16.0 min 50%B，25.0~30.0 min 100%B，30.1 min 5%B；柱温：30℃；DAD检测波长：280 nm。

B.二维液相色谱条件。色谱柱：Eclipse PAH柱（2.1 mm×100 mm，1.8μm）；A相：水；B相：乙腈；流速：0.3 mL/min；柱温：30℃；梯度洗脱条件：0~26.0 min 5%B，30.0~65.0 min 33%B，65.1~70.0 min 95%B，70.1 min 5%B。

C.补偿流路条件。色谱柱：Eclipse PAH柱（2.1 mm×50 mm，1.8μm）；流动相：水；流速：0.4 mL/min。

D.六通阀切换时间。0~19.0 min为第一维色谱分离除杂时间（阀1~阀2），19.0~26.0 min为捕集柱捕集阶段（阀1~阀6）；26.0 min后回到初始状态（阀1~阀2），为第二维色谱分析时间。质谱流路在30.0 min打开，75.0 min关闭。

E.质谱条件。离子源：喷射流技术电喷雾离子源（AJS-ESI）；扫描方式：负离子；监测模式：多反应监测（MRM）；干燥气温度：230℃；干燥气流速：15 L/min；雾化器压力（Nebulizer）：345 kPa；鞘气温度（Sheath gas temp）：400℃；鞘气流速（Sheath gas flow）：12 L/min；毛细管电压（Capillary）：负压2 000 V；喷嘴电压（Nozzle voltage）：负压2 000 V；RF高压（High pressure RF）：负压210 V；RF低压（Low pressure RF）：负压90 V。各物质及内标的定量离子对、碰撞能量（Collosion energy，CE）见表1。

表1 OHPAHs分析的质谱参数Tab.1 MS parameters for OHPAHs analysis

2 结果与讨论

2.1 二维液相色谱串联质谱系统搭建

建立的反相-反相2DLC-MS/MS系统，两维间采用不同极性的流动相及固定相，具有良好的正交性。第一维色谱以水-甲醇体系为流动相，C18色谱柱分离除杂；第二维色谱以水-乙腈体系为流动相，PAH色谱柱分离后进入质谱仪分析；两维间通过在线稀释将目标流份切割至捕集柱保留。

系统的分析过程由捕集模式和分析模式组成，如图1所示，转移过程采用“正冲”（即洗脱的方向和富集的方向相同）的方式。捕集柱常采用第二维分析柱的保护柱（长1 cm），但由于本方法中1 cm的保护柱难以实现10种PAHs有效保留，故采用5 cm的分析柱作为捕集柱。由于分析柱有固定的流动相流进和流出方向，因此转移过程中采用“正冲”方式。

图1 2DLC-MS/MS系统中捕集模式（a）及分析模式（b）示意图Fig.1 Schematic diagrams of the trapping process(a)and analyzing process(b)in 2DLC-MS/MSsystem

2.2 一维液相色谱条件优化

标准样品和尿液样品中OHPAHs的一维液相DAD色谱图见图2。可知，通过调节一维流动相洗脱梯度，可除去绝大多数杂质，极大地降低尿液分析时的基质干扰和抑制效应。根据目标物出峰时间确定中心切割范围为19.0~26.0 min。为了平衡捕集效率和系统压力，实验中通过优化一维目标物出峰时体系流速及相应补偿泵流速比例，最终确定补偿泵流速为0.4 mL/min。

图2 尿液样品（a）和标准样品（b）中OHPAHs的一维液相DAD色谱图Fig.2 DAD chromatograms of the first dimensional LC of OHPAHs in urine sample(a)and standard sample(b)

2.3 二维液相色谱条件优化

5种羟基菲同分异构体的分离是检测的难点，目前文献报道的方法均无法对5种同分异构体分别准确定量［12-19］。本研究中通过捕集柱和二维色谱柱的选择，以及二维流动相梯度洗脱条件的优化，实现了5种羟基菲同分异构体的基线分离及准确定量。标准样品及吸烟者尿液样品中10种OHPAHs的MRM色谱图如图3所示。

图3 标准样品（a）及吸烟者尿液样品（b）中10种OHPAHs的MRM图Fig.3 MRM chromatograms of 10 OHPAHs in standard sample(a)and smoker’s urine sample(b)

2.4 方法学验证

对标准工作溶液进行分析，以OHPAHs与对应内标的峰面积比为纵坐标，浓度比为横坐标进行线性回归，结果如表2所示，决定系数均大于0.99，线性关系良好。

表2 分析OHPAHs的线性方程、检出限及定量限Tab.2 Linear equations,LODs and LOQs for OHPAHs analysis

本方法的检出限和定量限分别为0.001~0.021和0.005~0.070 ng/mL，与文献［13-14，16］中报道的其他方法的检出限和定量限一致（表3），可满足尿液样品中痕量OHPAHs的检测需求。

表3 本方法与其他方法检出限和定量限的比较Tab.3 Comparisons of LODs and LOQs between this method and other methods

对样品进行加标回收及日间和日内精密度考察，结果见表4。可知，尿液样品中目标物的回收率为87.9%~129.1%，样品的日内和日间RSD分别为1.1%~4.1%和1.4%~4.8%。表明方法的重复性好、稳定性高，满足日常检测需要。

表4 方法的精密度和回收率Tab.4 Precisions and recoveries of this method

2.5 尿液样品分析

采用本方法分别对6名吸烟者、6名非吸烟者的尿液样品及5个人工尿液加标样品进行分析，结果见表5。可知，该方法能够满足不同类型尿液样品分析的需要。

由表5可知，吸烟者的分析结果存在明显的个体差异，可能与其吸烟习惯及个体代谢差异有关。此外，由于PAHs广泛存在于食品、环境、烟气及汽车尾气等中，因此非吸烟者尿液中也能检测到OHPAHs［15］。由吸烟者和非吸烟者尿液中10种OHPAHs检测结果可知，2-OHNap、1-OHNap和1-OHPry的浓度相对较高，4-OHPhe和9-OHPhe的浓度相对较低，且吸烟者与非吸烟者之间存在一定差异。本研究中吸烟者尿液中OHPAHs的浓度明显高于非吸烟者，以1-OHNap、2-OHFlu、3-OHFlu、4-OHPhe和9-OHPhe的差异最为显著。但是考虑到样本数量太少以及并未采用肌酐进行个体差异矫正，因此对吸烟者和非吸烟者尿液中OHPAHs的差异仍需进一步研究。本方法所测样品中OHPAHs的浓度范围与文献［12-15］的报道一致，可满足吸烟人群和非吸烟人群尿液中痕量OHPAHs准确测定的需求。

表5 （续）

表5 尿液样品分析结果Tab.5 Analytical results of urine samples （ng·mL-1）

3 结论

①建立了人尿液中痕量多环芳烃暴露生物标志物的二维液相色谱-串联质谱分析方法，尿液样品仅需酶解过滤后可直接上机分析。②本方法无需萃取浓缩即可满足检测需求，同时有效解决了5种羟基菲同分异构体准确定量的难题，可用于吸烟者和非吸烟者尿液中OHPAHs的准确测定。③方法简单便捷、仪器全自动、结果可靠，可为烟气暴露风险评价提供更为高效、准确的技术手段，为吸烟与健康的深入研究提供有力支撑。