液相色谱法测定土壤中四环素含量前处理方法的优化

李金津，胡宏宇，王弘圣，伍玉鹏

华中农业大学资源与环境学院，湖北 武汉 430070

抗生素由于其在保护动物健康方面的作用，在我国规模化和集约化畜禽养殖中得到了广泛应用［1-2］。然而，抗生素在畜禽体内不会被完全吸收，约40%～90%的抗生素以母体化合物或主要代谢物形式随畜禽粪便或尿液排出体外［1］。其中，四环素类药物是使用最多、最广泛的一类抗生素，由于其具有水溶性较好、体内代谢后大部分以原形排出以及在环境中不易发生生物降解等特点，成为容易在环境中储存和蓄积的一类抗生素［3］。尤其是在农田中，作为土壤有机质及养分重要来源的畜禽粪便年复一年地进行施用，导致了土壤中四环素类抗生素浓度不断增加，对人类健康和生态造成了潜在的不利影响［3-5］。在此背景下，准确定量土壤四环素污染程度，是科学合理开展土壤利用及四环素污染治理的关键。

四环素类抗生素残留的分析方法包括微生物法、酶联免疫法、薄层色谱法和液相色谱法，其中微生物法和酶联免疫法存在特异性差，耗时长及操作繁琐等缺点，而薄层色谱法的测量灵敏度难以达到要求［6-8］。因此，液相色谱法成为目前最主要的分析测定方法，并广泛应用于畜禽养殖农产品、食物样品的监测中［9］。Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液是动物性食品中四环素的常用浸提剂，但其对不同类型四环素浸提的效果存在较大差异［10-12］。李彦文等［13］在缓冲液中加入甲醇，抗生素的提取效率有了一定的提高，但仍存在浓缩时间较长提取杂质增多等问题。此外，土壤基质与食品基质差异较大，土壤含带有负电性的有机质及具有多孔隙的粘土矿物质，对四环素类抗生素具有较强吸附作用，这对土壤中四环素类抗生素的前处理方法提出更高要求［14］。因此，本研究从浸提剂的选择、浸提液固相萃取的方法及溶解液的选择入手，通过三因素完全随机实验比较了不同组合下四环素提取率的差异，以期能够通过对现有方法的优化进而提供一种更为高效、准确的土壤样品四环素测定方法。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

1.1.1 主要化学试剂 四环素为标准品（Sigma公司），甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯（德国Merck公司），草酸、磷酸氢二钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、草酸、乙醇、氯化钠等试剂均为分析纯。

1.1.2 供试土壤 供试土壤为黄棕壤，取自华中农业大学试验田。供试牛粪取自湖北田申甲生物环保科技有限公司。供试四环素为标准品，购自Sigma公司。将土壤与牛粪按照1∶1比例混合以模拟畜禽粪便农田施肥。在混合物中加入5 mg/kg四环素-甲醇溶液，充分搅拌均匀，将物料摊平静置2 d，让甲醇挥发完全，随后将物料置于50℃烘箱中烘干并研磨过孔径2 mm筛，形成本研究中的待测物料。

1.2 实验设计

从四环素浸提剂的选择、浸提液固相萃取的方法及溶解液的选择入手，开展三因素完全随机实验。本研究选择2种浸提剂，分别是浸提剂1：Na2EDTA-Mcllvaine-甲 醇 浸 提 剂（Na2EDTAMcllvaine-甲醇提取液，pH=4.0），浸提剂2：草酸/乙醇浸提剂（1 mol/L NaCl、0.5 mol/L草酸和乙醇按照25∶25∶50的体积进行混合，pH=7.0）。本研究选择2种浸提液固相萃取方法，分别是方法1：Oasis HLB固相萃取柱使用前，先用2 mL甲醇洗涤3次，然后用2 mL超纯水洗涤3次，最后用2 mL盐酸（pH=4）洗涤3次以进行预处理。将浸提液以1 mL/min的速率通过Oasis HLB固相萃取柱进行富集，萃取富集后，用6 mL超纯水清洗固相萃取柱，并减压抽干5 min。最后用6 mL甲醇缓慢洗脱到10 mL离心管中并编号［15-16］。方法2：用2 mL甲醇、2 mL超纯水活化Oasis HLB固相萃取柱，将浸提液以1 mL/min的速率通过Oasis HLB固相萃取柱进行富集，萃取富集后，用5 mL超纯水、5 mL甲醇-水（5∶95，V/V）淋洗，减压抽干10 min后用5 mL的甲醇溶液缓慢洗脱到10 mL离心管里并编号。本研究选择3种溶解液，分别是溶解液1：pH=4的盐酸溶液，溶解液2：色谱纯甲醇，溶解液3：超纯水溶液［15-16］。因此，本研究共12个处理（2种浸提剂×2种固相萃取方法×3种溶解液）（表1），每个处理3个重复。

表1 提取四环素的不同处理Tab.1 Extractions of tetracycline under different treatments

取过筛的样品1 g置于50 mL带盖塑料离心管中，分别吸取20 mL上述提取液（Na2EDTAMcllvaine-甲醇浸提剂或草酸/乙醇浸提剂），于机械振荡提取仪中25℃下振荡提取20 min，取出超声20 min后于15℃下置于离心机上，离心速度为8 000 r/min，离心10 min，取上清液至另一50 mL离心管。残渣再依次加入20、10 mL提取液，重复上述步骤提取2次，合并上清液［12-13］。上清液及洗涤液混合后采取上述2种方法（方法1和方法2）对浸提液进行固相萃取。将样品倒入石英蒸发皿，在40℃下水浴蒸发至近干，分别用2 mL上述3种溶解液（pH=4的盐酸溶液、色谱纯甲醇、超纯水溶液）搅拌溶解，过孔径0.22μm滤膜后打入进样瓶并编号。用高效液相色谱测定，测定色谱条件为：日本岛津Shim-Pack，VP-ODS柱（250 mm×4.6 mm，5µm）色谱柱，色谱柱柱温25℃，流动相为体积分数0.1%甲酸-乙腈（81∶19，V/V）等度洗脱，流速1.0 mL/min，进样量20μL；紫外检测器检测：波长270 nm［9］。

1.3 数据统计与分析

所有实验数据均以均值表示，采用SPSS 17.0（IBM，USA）统计软件对不同处理进行相关的统计分析、差异检验等（显著水平为0.05）。

2 结果与讨论

图1显示，不同处理组合下四环素的提取率存在较大差异。其中第10号处理，即选择草酸/乙醇作为浸提剂，采用浸提液固相萃取方法2并使用甲醇作为溶解液的组合四环素提取率达到100%，显著高于其它处理。接下来为第4号处理，即选择Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇作为浸提剂，采用浸提液固相萃取方法2并使用甲醇作为溶解液的组合，其四环素提取率为75.2%。除此之外，第1、2号处理，即选择Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇作为浸提剂，采用浸提液固相萃取方法1并选择甲醇或盐酸作为溶解液的组合四环素提取率也达到了50%以上。本研究中第8号处理，即选择草酸/乙醇作为浸提剂，采用浸提液固相萃取方法1并选择盐酸作为溶解液的组合未能提取到四环素，说明该方法完全不能应用于土壤四环素的测定。

图1 不同处理方法条件下的四环素提取率Fig.1 Extraction rates of tetracycline under different treatments

提取剂、固相萃取方法及溶解液三个因素对四环素提取效率的影响做进一步的主体间效应检验。结果显示，提取剂、固相萃取方法及溶解液单独作用下影响四环素提取率的Sig.值均为0.000，说明三因素单独作用下均显著影响了四环素的提取率；提取剂与固相萃取方法交互作用下影响四环素提取率的Sig.值为0.001，而提取剂与溶解液、固相萃取方法与溶解液交互作用下影响四环素提取率的Sig.值均为0.000，说明三因素中任意两两交互作用下显著影响了四环素的提取率；提取剂、固相萃取方法及溶解液影响四环素提取率的Sig.值均为0.000，说明三因素之间交互作用亦显著影响了四环素的提取率（表2）。

表2 不同提取剂、固相萃取方法及溶解液的四环素提取率方差分析结果Tab.2 Results of variance analysis in extraction rate of tetracycline obtained with different extractants,solid phase extraction methods and dissolved solutions

因本研究采用了3种不同的溶解液，因此进一步对溶解液之间的差异进行分析，发现使用甲醇与使用盐酸作为溶解液的处理之间四环素提取率差值达31.565，差异显著；使用甲醇与使用超纯水作为溶解液的处理之间四环素提取率差值达37.125，差异显著；而使用盐酸与使用超纯水作为溶解液的处理之间四环素提取率差值仅为5.560，差异不显著（表3）。

表3 不同溶解液对四环素提取率的影响Tab.3 Effectsof different dissolution solutionson extraction rates of tetracycline

3 结 论

选择草酸/乙醇（1 mol/L NaCl、0.5 mol/L草酸和乙醇按照25∶25∶50的体积比进行混合，pH=7.0）作为萃取溶剂，用2 mL甲醇、2 mL超纯水活化Oasis HLB固相萃取柱，将浸提液以1 mL/min的速率通过Oasis HLB固相萃取柱进行富集，用5 mL超纯水、5 mL甲醇-水（5/95，V/V）淋洗，减压抽干10 min后用5 mL的甲醇溶液缓慢洗脱，石英蒸发皿中40℃下水浴蒸发至近干，2 mL色谱纯甲醇搅拌溶解，最后过孔径0.22μm滤膜，是采用高效液相色谱测定土壤四环素含量较优的前处理方法。该前处理方法下四环素提取率可达100%，可有效提高土壤中四环素含量测定的效率与准确性。然而，针对其它不同的测定对象（如畜禽粪便），需要进一步针对性的开展研究以确定最优前处理方法。