基于UPLC-Q-TOF/MS技术的橘皮竹茹汤血清药物化学初步研究*

王小双，魏文峰，韩德强，霍金海，王伟明

（黑龙江省中医药科学院中药研究所，哈尔滨 150036）

橘皮竹茹汤源自张仲景的《金匮要略》，由橘皮、大枣、竹茹、人参、生姜、甘草组成。原文为：“哕逆者，橘皮竹茹汤主之。”后世医家以“胃虚有热，胃气上逆”“寒热相搏”“脾胃虚寒，胃失和降”等概括本方病因病机[1]。现代研究表明，橘皮竹茹汤已广泛应用于医治慢性胃炎、幽门水肿、幽门不全梗阻、消化性溃疡、消化功能不良引起的呕吐、反流性食管炎等疾病[2-4]。

超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用（UPLC-Q-TOF/MS）技术是一种具有高分辨率、高灵敏度特点的质谱技术。目前大量研究报道了UPLC-Q-TOF/MS作为一种分析方法被应用于中药或中药复方的入血成分研究，且实验结果良好[5-6]。

中药成分复杂，想要确定中药入血后的有效成分并阐明其药效物质基础，通过现代化的分析手段对其给药后血清进行原型成分以及代谢产物分析是必不可少的。同时，尚未有橘皮竹茹汤入血成分研究的相关报道，所以本实验旨在采用UPLC-QTOF/MS技术推断或鉴定其入血成分。

1 材料与仪器

1.1 仪器 实验用仪器具体情况见表1。

表1 实验仪器情况

1.2 试剂与药品 对照品甘草酸（批号G-003-160330）、刺芒柄花素（批号 C-018-160304）购于成都瑞芬思生物科技有限公司；柚皮苷（批号110722-201815）购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸（色谱纯，美国Fisher公司）；屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；甲醇（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；水合氯醛（批号20100827，天津市光复精细化工研究所）；自制橘皮竹茹汤冻干粉（陈皮饮片购自湖北随州，批号17112111；竹茹饮片购自安徽岳西，批号1708311；大枣饮片购自河北安国，批号1709061；人参饮片购自吉林通化，批号180311；生姜饮片购自浙江磐安，批号ZJP2011165；甘草饮片购自甘肃陇西，批号17111411）。

1.3 实验动物 健康雄性Wister大鼠，体质量（200±20）g，SPF级，由哈尔滨医科大学动物实验中心供给，许可证号：SYXK（黑）2016-008。大鼠于SPF级动物室饲养，室温20～25℃，湿度50%～70%。

2 实验方法

2.1 供试品溶液的制备 取橘皮竹茹汤冻干粉1.0g，精密称定，加甲醇25 mL，超声处理（功率300 W，频率 40 KHz）30 min，放冷，补足甲醇，摇匀，滤过，取续滤液，13 000 r/min离心5 min（离心半径7 cm），取上清液，即得。

2.2 给药药液的制备 取橘皮竹茹汤冻干粉，加适量蒸馏水超声溶解，制成0.108 g/mL药液供大鼠灌胃使用。

2.3 血清样本的制备 Wister大鼠禁食12 h（自由饮水），给药组按照10.8 g/kg（相当于人体临床1 d剂量的10倍）灌胃橘皮竹茹汤冻干粉药液，空白组按照10.0 mL/kg灌胃蒸馏水。给药1 h后，腹腔注射5%水合氯醛麻醉，取腹主动脉血，离心（3 000 r/min，10 min，离心半径7 cm），取上清液，-80℃保存。

取大鼠空白血清及给药血清各400 μL，各加入10 μL 磷酸，涡旋震荡（2 500 r/min），分别加入 1.6 mL乙腈，涡旋震荡（2 500 r/min），离心（13 000 r/min，4℃，10 min，离心半径 7 cm），取上清液，氮气流吹干，残渣用200 μL甲醇复溶，涡旋震荡（2 500 r/min，60 s），离心（13 000 r/min，4 ℃，10 min，离心半径7 cm），取上清液，供UPLC-Q-TOF/MS分析。

2.4 色谱条件 Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），ACQUITY UPLC BEH C18VanGuard Pre-Column预柱（2.1mm×5mm，1.7μm），柱温35℃，0.1%甲酸水为流动相A，0.1%甲酸乙腈为流动相 B，梯度洗脱（0～3 min，0%～5%B；3～10 min，5%～50%B；10～18 min，50%～100%B；18～18.1 min，100%～5%B；18.1～20 min，5%B），流速 0.3 mL/min，进样量 5 μL。

2.5 质谱条件 质谱条件设置见表2。

表2 质谱条件

2.6 数据分析方法 将橘皮竹茹汤给药血清和空白血清导入Peakview软件，设置相关参数（Mass Errorr≤10；权重30%，Isotope≤10%；权重30%，Formula Finderscore＞70%）扣除空白血清成分干扰，将检测到的其余离子与体外药材提取液所检测到化合物的保留时间、母离子精确质量数、同位素峰度比及二级质谱图进行比较，相同则确认为橘皮竹茹汤冻干粉中的原型成分[7]。

运用MetabolitePilot 2.0.4软件，导入前期推断或鉴定的橘皮竹茹汤化学成分的结构式和总离子流图，为每一个化学成分设置不同的Biotransformation parameters，选择所有可能的Ⅰ、Ⅱ相代谢途径，设 置 Generic ParametersPeak、Finding Strategy 和Compound-Specific Parameters，给药血清的液质采集数据为sample，空白血清的液质采集数据为control进行分析[8-9]，最后结合软件及相关文献给出代谢物的保留时间及二级碎片，推断可能的代谢物。

3 结果

3.1 橘皮竹茹汤UPLC-Q-TOF/MS色谱图的采集 根据建立的橘皮竹茹汤血中移行成分分析方法，采用正、负离子模式采集橘皮竹茹汤冻干粉样品、给药血清和空白血清数据。正离子模式总离子流图见图1，负离子模式总离子流图见图2。

图1 正离子模式下总离子流图

图2 负离子模式下总离子流图

3.2 橘皮竹茹汤血中移行成分分析与鉴定 根据“2.6”项的分析方法，结合对照品比对及文献报道[10-15]，鉴定出大鼠灌胃橘皮竹茹汤冻干粉后的血中移行成分41个，包括原型成分13个、代谢产物28个。见表3。

表3 橘皮竹茹汤冻干粉血中移行成分分析结果

续表3

续表3

3.3 主要色谱峰的质谱分析

3.3.1 原型成分的鉴定 本研究鉴定了原型成分13个，以化合物2和9说明推测过程。

化合物2：负离子模式下，化合物2在含药血清总离子流图的柚皮苷保留时间与样品总离子流图一致，二级质谱碎片一致，准分子离子峰m/z 579.175 7相对丰度较强，拥有共同二级碎片m/z 403.143 4、271.062 1、151.002 9 等。通过查询相关成分的文献[16]，推断化合物2为柚皮苷。二级质谱图见图3，其可能的裂解过程见图4。

图3 柚皮苷负离子模式下的质谱图

图4 推测的柚皮苷裂解途径

化合物9：正离子模式下，化合物9在含药血清总离子流图与样品总离子流图甘草酸的保留时间一致，二级质谱碎片一致，准分子离子峰m/z 823.409 4相对丰度较强，拥有共同二级碎片m/z 647.377 3、471.344 9、369.236 9 等。通过查询相关成分的文献[17]，推断化合物9为甘草酸。二级质谱图见图5，其可能的裂解过程见图6。

图5 甘草酸正离子模式下的质谱图

图6 推测的甘草酸裂解途径

3.3.2 代谢产物的鉴定 本研究推测了28个代谢产物，以化合物20和化合物37为例说明鉴定过程。

化合物20：刺芒柄花素是来自甘草的黄酮类成分，易发生Ⅱ相代谢反应。通过MetabolitePilot代谢软件分析发现，化合物20为刺芒柄花素A环7位发生葡萄糖醛酸化的产物。该产物在负离子模式下，准分子离子峰m/z 443.101 7[M-H]-，比刺芒柄花

素准分子离子峰m/z 267.065 9[M-H]-多176.035 8，符合1分子葡萄糖醛酸的分子量。结合其特征碎片m/z 267.065 9、252.042 9、223.042 1 等，与刺芒柄花素的二级碎片相一致，符合其葡萄糖醛酸化的过程。结合文献报道[18]，芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖经Ⅰ相代谢水解反应后，转化为芒柄花素，易发生

葡萄糖醛酸化反应。二级质谱图见图7，其可能的裂解过程见图8。

图7 刺芒柄花素葡萄糖醛酸化产物负离子模式下的质谱图

图8 推测的刺芒柄花素葡萄糖醛酸化产物裂解途径

化合物37：柚皮黄素是陈皮中的黄酮类成分，易发生Ⅰ相代谢反应。通过MetabolitePilot代谢软件分析发现，化合物37为柚皮黄素C环3位脱羟基产物。在正离子模式下，准分子离子峰为m/z 403.136 7[M+H]+比柚皮黄素准分子离子峰m/z 419.148 2[M+H]+少16，提示失去1个氧原子，发生脱羟基。结合二级质谱碎片离子 m/z 388.110 6、373.091 8、345.089 1等，与柚皮黄素的二级质谱碎片相比较，符合脱羟基过程。其准分子离子峰m/z 401.367 3丢失甲基产生m/z 388.110 6碎片离子，继续丢失C环上的1分子一氧化碳和1个氧原子产生m/z 345.089 1碎片离子。另一条裂解途径为A环甲氧基丢失，同时导致C环C-O键断裂产生m/z 373.091 8碎片离子，m/z 373.091 8碎片离子丢失亚甲基产生m/z 359.114 6碎片离子。根据文献报道[19]，该柚皮黄素脱羟基产物与川陈皮素的裂解规律一致，所以推测柚皮黄素脱羟基产物为川陈皮素。二级质谱图见图9，其可能的裂解过程见图10。

图9 柚皮黄素脱羟基产物正离子模式下的质谱图

图10 推测的柚皮黄素脱羟基产物裂解途径

4 讨论

本实验考察了不同给药剂量（1、5和10倍），结果显示，10倍给药剂量的响应值最高，色谱峰最多，故10倍是最佳给药剂量。考察了4种血清处理方法（乙腈沉淀法、甲醇沉淀法、固相萃取-乙腈洗脱和固相萃取-甲醇洗脱），结果显示，乙腈沉淀法是血中移行成分最多的一种方法，故乙腈沉淀法是血清最佳处理方法。考察了8个不同采血时间节点（0、0.5、1、2、4、8、12、24 h），结果显示，给药 1 h 检测到的峰数目最多，故最佳采血时间节点为给药后1h。

本实验对大鼠进行灌胃给予橘皮竹茹汤冻干粉的含药血清，推断了41个血中移行成分，其中原型成分13个、代谢产物28个，来自陈皮的主要是黄酮类成分，包括橙皮苷、柚皮黄素等，能够清除羟自由基、保护膜损伤、抑制幽门螺杆菌增殖、抗炎及增强幽门泵活动促进胃排空[20]。来自甘草的主要是黄酮类和三萜类成分，甘草中的甘草次酸能够抑制幽门螺杆菌感染后的胃黏膜上皮细胞凋亡，发挥抗炎作用[21]。来自生姜的主要是姜辣素类成分，包括6-姜酚、6-姜烯酚等，能够抑制胃黏膜上5-羟色胺3（5-HT3）和5-羟色胺4（5-HT4）受体发挥止吐作用[22]。结合各味药物的传统药效及药理作用，初步推测本实验得到的41个入血成分可能是其发挥药效的物质基础。