BDNF/TrkB通路对硫化氢减轻同型半胱氨酸诱导大鼠海马神经元凋亡的影响

魏海军 肖凡

[摘要] 目的 探討BDNF 受体酪氨酸蛋白激酶B（TrkB）通路对硫化氢（H2S）减轻同型半胱氨酸（Hcy）诱导大鼠海马神经元凋亡的影响。 方法 将雄性SD大鼠随机分为六组，分别为对照组、损伤组（Hcy，0.6 μmol）、损伤+保护组[Hcy（0.6 μmol）+NaHS（100 μmol/kg）]、对照+保护组[正常+NaHS（100 μmol/kg）]及抑制保护组[Hcy（0.6 μmol）+NaHS（100 μmol/kg）+BDNF/TrkB的特异性抑制剂K252a（1 μg/d）]、对照+抑制组（正常+K252a 1 μg/d），每组8只;Tunel染色法分析大鼠海马CA1区神经元的凋亡情况，蛋白质印迹法（Western blot）分析Caspase-3、Bcl-2在海马中的表达。 结果 与损伤组比较，损伤+保护组大鼠海马CA1区神经元着色细胞数减少，着色变浅，凋亡百分率明显降低（P<0.01），并且Caspase-3蛋白相对表达量明显降低，而Bcl-2蛋白相对表达量升高（P<0.01）;与损伤+保护组比较，抑制保护组大鼠海马CA1区神经细胞凋亡率明显增高（P<0.01），Caspase-3蛋白相对表达水平升高，而Bcl-2蛋白相对表达水平降低（P<0.01）。 结论 BDNF/TrkB通路参与硫化氢减轻同型半胱氨酸诱导的大鼠海马神经元凋亡。

[关键词] BDNF/TrkB通路;硫化氢;同型半胱氨酸;海马神经元凋亡

[中图分类号] R743.3&nbsp;         [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2022）02-0034-03

Effect of BDNF/TrkB pathway on hydrogen sulfide attenuating homocysteine-induced apoptosis of hippocampal neurons in rats

WEI Haijun1   XIAO Fan2

1.School of Medicine， Hunan Polytechnic of Environment and Biology， Hengyang   421005， China; 2.Clinical Research Institute， Affiliated Nanhua Hospital， University of South China， Hengyang   421001， China

[Abstract] Objective To explore the effect of brain-derived neurotrophic factor （BDNF） receptor/tyrosine kinase receptor B （TrkB） pathway on hydrogen sulfide （H2S） attenuating homocysteine （Hcy）-induced apoptosis of hippocampal neurons in rats. Methods Male SD rats were randomly divided into 6 groups， namely， the control group， the injury group （Hcy， 0.6 μmol）， the injury+protection group （Hcy [0.6 μmol]+NaHS [100 μmol/kg]）， the control+protection group （normal+NaHS [100 μmol/kg]） and the inhibition+protection group （Hcy [0.6 μmol]+NaHS [100 μmol/kg]+specific inhibitor of BDNF/TrkB [K252a （1 μg/d]）， the control+inhibition group （normal+K252a [1 μg/d]）， with 8 rats in each group. Apoptosis of hippocampus neurons in CA1 region of rats was analyzed by Tunel staining， and the expressions of Caspase-3 and Bcl-2 in the hippocampus was analyzed by protein blotting （Western blot）. Results Compared with the injury group， the number of stained neurons in the CA1 region of hippocampus in the injury+protection group decreased with lighter coloration， and the apoptosis rate was significantly lower（P<0.01）. Meanwhile， the relative expression of Caspase-3 protein significantly decreased while that of Bcl-2 protein elevated（P<0.01）. Compared with the injury+protection group， the rate of apoptosis in the CA1 region of hippocampus in the inhibition+protection group was significantly higher（P<0.01）.Meanwhile，the relative expression of Caspase-3 protein elevated while that of Bcl-2 protein decreased（P<0.01）. Conclusion BDNF/TrkB pathway is involved in H2S attenuating homocysteine-induced apoptosis in rat hippocampal neurons.

[Key words] Brain-derived neurotrophic factor/tyrosine kinase receptor B pathway; Hydrogen sulfide; Homocysteine; Apoptosis of hippocampal neurons

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）在脑内的累积会易化应激认知功能障碍，成为神经系统疾病的一种危险因素，尤其与老年痴呆的发生发展密切相关[1]。因此，有关Hcy损伤神经系统的机制及其预防、治疗具有重要研究价值。而硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）在神经保护方面发挥重要作用，尤其是在阿尔茨海默病（Azheimer′s disease，AD）中起到保护作用，其机制包括抗氧化、抗凋亡等[2]。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是神经系统中的重要神经营养因子，并且在硫化氢的神经保护作用中发挥重要作用，本研究将从BDNF受体酪氨酸蛋白激酶B（TrkB）通路的新角度，采取Tunel染色法、Western blot的方法，分析H2S对Hcy损伤神经元后引起的神经元凋亡率、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达的影响，探讨H2S减轻同型半胱氨酸导致的海马神经元凋亡是否与BDNF/TrkB通路有关，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

1.1.1 实验动物  雄性SD大鼠（260～300 g），由长沙斯莱克景达实验动物有限公司提供。实验过程都遵守国家颁布的《实验动物管理条例》的规定，且获得本单位医学实验动物伦理委员会的批准。动物许可证号：SYXK（湘）2015-0001，及试验场所为南华大学。

1.1.2 试剂  NaHS和Hcy由Sigma公司提供;兔抗Caspae-3、鼠抗Bcl-2由单抗武汉博士德公司提供。

1.2 方法

1.2.1 动物分组  将雄性SD大鼠随机分为6组，分别是对照组、损伤组（Hcy，0.6 μmol）、损伤+保护组[（Hcy（0.6 μmol）+NaHS（100 μmol/kg）]、对照+保护组[（正常+NaHS（100 μmol/kg）]及抑制保护组[Hcy（0.6 μmol）+NaHS（100 μmol/kg）+BDNF受体酪氨酸蛋白激酶B（TrkB）的特异性抑制剂K252a（1 μg/d）]、对照+抑制组[正常+K252a（1 μg/d）]，每组各8只。

1.2.2 给药方法  对照组侧脑室注射等体积生理盐水7 d;损伤组侧脑室注射0.6 μmol的Hcy 7 d;损伤+保护组进行腹腔注射NaHS[100 μmol/（kg·d）]2 d后，再同时进行侧脑室注射Hcy（0.6 μmol/d）7 d;对照+保护组进行腹腔注射NaHS[100 μmol/（kg·d）]2 d后，再同时进行侧脑室注射等体积的生理盐水7 d;抑制保护组进行侧脑室注射K252a（1 μg/d）2 d后及腹腔注射NaHS[100 μmol/（kg·d）]2 d后，再同时进行侧脑室注射 Hcy（0.6 μmol/d）7 d。

1.2.3 Western blot测定海马Caspase-3、Bcl-2蛋白表达水平  在冰上将RIPA裂解液加入海马组织中进行研磨及高速离心10 min后，收集海马组织匀浆上清液进行测定各样本蛋白浓度（BCA法），再进行电泳、转印，转印后将PVDF膜放入TTBS缓冲液中（摇动5 min），再将其取出放入脱脂奶粉中（摇动1 h）后，加入一抗孵育（4℃封闭过夜），再加入二抗孵育（37℃震荡1 h），最后进行显影成像并采用AlphEase FC软件分析Caspase-3、Bcl-2条带灰度值。

1.2.4 石蜡切片Tunel染色分析大鼠海马神经元的凋亡  将大鼠海马组织进行切片脱蜡、水合、蛋白酶K消化（30 min），加入Tunel反应液（60 min），DAB显色（10 min），苏木素复染（3 s），温水返蓝（10 min）后，进行脱水、透明、封片，绿光源荧光显微镜分析并拍照。首先镜下定位海马CA1区（100×），再观察取图（200×），Tunel阳性细胞核为棕黄色，Tunel阴性细胞核为蓝色，采用Image ProPlus 6.0对Tunel阳性细胞计数。

1.3 观察指标及评价标准

通過检测各组大鼠海马 CA1 区神经元的凋亡阳性率（细胞内有棕黄色细腻颗粒弥漫或棕黄色粗颗粒分布者为阳性细胞）及凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2的表达。神经元的凋亡阳性率越高，Caspase-3表达上调及Bcl-2表达下调代表神经元凋亡程度越严重[3]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用LSD-t检验分析进行两两比较，而随机成组设计使用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H2S可拮抗Hcy导致的大鼠海马CA1区神经元凋亡

实验表明，与损伤组比较，损伤+保护组大鼠海马CA1区神经元着色细胞数减少，着色变浅，凋亡百分率明显降低（P<0.01）。见表1、封三图5。并且Caspase-3蛋白相对表达量明显降低，而Bcl-2蛋白相对表达量升高（P<0.01）。见表1。提示H2S 可拮抗 Hcy 导致的大鼠海马CA1区神经元凋亡。

2.2 K252a 可抑制 H2S 对 Hcy导致的大鼠海马神经元凋亡的拮抗作用

实验表明，与损伤+保护组比较，抑制保护组大鼠海马CA1区神经细胞凋亡率明显增高（P<0.01）。见表2、封三图6。Caspase-3蛋白相对表达水平升高而Bcl-2蛋白相对表达水平降低（P<0.01）。见表2。提示硫化氢减轻同型半胱氨酸诱导的大鼠海马神经元凋亡与BDNF/TrkB通路有关。

3 讨论

同型半胱氨酸是甲硫氨酸代谢出现的一种含硫氨基酸，其生存和清除在人体内会保持一个动态平衡的过程。同型半胱氨酸上升是心脑血管疾病发展的关键危险因素，也有数据认为同型半胱氨酸的上升，可能造成患者认知功能障碍。研究发现，老年痴呆患者同型半胱氨酸水平高于健康体检人员，H2S水平低于健康人群，且与病情严重程度具有密切关联[4]。本研究通过对SD雄性大鼠进行侧脑室注射Hcy以建立Hcy神经毒性动物模型，实验结果显示，与对照组比较，损伤组大鼠海马CA1区神经细胞核呈棕黄色，且着色细胞数多，着色深，凋亡率明显升高，Caspase-3蛋白相对表达水平增加而Bcl-2蛋白相对表达水平降低;表明Hcy可引起大鼠海马神经元的凋亡，这也进一步证实了Hcy的神经危害。

在一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）、一氧化碳（carbon monoxide，CO）被发现之后，H2S也被发现是一种内源性气体分子，具备神经保护的特性[5-7]，它在霍奇金病（Hodgkin disease，HD）、阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）、肌萎缩侧索硬化（amyotrophiclateralsclerosis，ALS）、帕金森病（Parkinson′s disease，PD）、脑缺血、热性惊厥（febrileseizure，FS）等神经系统疾病中起到重要作用[8]。细胞凋亡其实是一种细胞主动自毁过程，它受到基因的调控。其中Caspase-3是一种加速凋亡的基因，它在正常大脑发育及细胞的凋亡中起着很大作用，生理条件下的Caspase-3是没有活性的，但是当它接收到凋亡信号刺激后就会被活化，进一步导致DNA裂解，从而引发细胞凋亡[9]。Bcl-2是阻碍凋亡的基因，Bcl-2蛋白水平增高时可抑制因氧自由基导致的细胞凋亡[10]。本研究结果显示，与损伤组比较，损伤+保护组大鼠海马CA1区神经元着色细胞数减少，着色变浅，凋亡百分率明显降低，并且Caspase-3蛋白相对表达量明显降低而Bcl-2蛋白相对表达量升高;提示H2S可拮抗 Hcy导致的大鼠海马CA1区神经元凋亡。李国风等[3]研究指出，H2S可显著抑制局灶性脑缺血损伤导致的神经元凋亡，表明H2S在抗神经元凋亡方面起着重要作用，但是其机制需进一步深入挖掘和研究。

BDNF是一种神经保护因子[11-13]，它主要分布于中枢神经系统、外周神经系统中，其作用体现为具有神经修复、神经再生的特性[14]。BDNF及BDNF/TrkB通路在神经系统疾病的研究中受到广泛的关注。TrkB是神经营养蛋白酪氨酸激酶受体家族的一员，其在学习记忆中发挥着重要作用[15]。本研究结果显示，与损伤+保护组比较，抑制保护组大鼠海马CA1区神经细胞凋亡率明显增高，Caspase-3蛋白相对表达水平升高而Bcl-2蛋白相对表达水平降低;提示硫化氢减轻同型半胱氨酸诱导的大鼠海马神经元凋亡与BDNF/TrkB通路有关。

综上所述，本文为H2S拮抗Hcy神经细胞凋亡的研究提供了理论基础，但是还需要在未来的研究中更加深入地进行探索。

[参考文献]

[1] 薛聪，谢方，赵云.应激性认知障碍小鼠脑内同型半胱氨酸的代谢变化研究[J].军事医学，2021，45（5）：348-353.

[2] 魏海军，张庆丽，王玥.硫化氢对阿尔茨海默病的保护作用研究进展[J].湖南生态科学学报，2021，8（1）：89-94.

[3] 李国风，张勤增，解丽君.硫化氢对局灶性脑缺血损伤大鼠脑组织神经元凋亡的影响[J]. 河北医药，2020，42（8）：1135-1139.

[4] 段周芳，吴丹丹，赵丹.老年痴呆患者同型半胱氨酸、硫化氢水平及临床意义[J].四川解剖学杂志，2020，28（3）：137-138.

[5] Kumar M，Sandhir R. Hydrogen sulfide attenuates hyperhomocysteinemia-induced mitochondrial dysfunctions in brain[J].Mitochondrion，2020，50：158-169.

[6] 贾强，李焱，刘小粉.硫化氢对糖尿病大鼠空间学习记忆和海马组织氧化应激的影响[J]. 蚌埠医学院学报，2020，45（4）：447-451.

[7] Tabassum R，Jeong NY.Potential for therapeutic use of hydrogen sulfide in oxidative stress-induced neurodegenerative diseases[J].Int J Med Sci，2019，16（10）：1386-1396.

[8] 張书虎，李静，马兰.硫化氢代谢与神经保护作用[J].中华老年多器官疾病杂志， 2019，18（4）：308-312.

[9] 马瑞松，江洪，李元红.青蒿素抑制心肌缺血再灌注中的细胞凋亡[J].现代医学，2016，44（7）：919-922.

[10] 吕书博，张展，赵德华. 苯丙酮尿症大鼠海马神经元损伤及其与BDNF/TrkB通路的关系[J]. 东南大学学报（医学版），2019，38（3）：461-466.

[11] 薛梦，黄诚. BDNF/TrkB信号通路与神经病理性疼痛的关系研究[J]. 赣南医学院学报，2020，40（1）：14-19.

[12] 赵彬，唐强，朱路文. 丰富环境对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠海马神经元凋亡及脑源性神经营养因子/酪氨酸蛋白激酶受体信号通路的影响[J].中国康复理论与实践，2019，25（12）：1418-1424.

[13] 林玲，刘国良，杨丽娜. 西红花苷基于BDNF-TrkB信号通路改善阿尔茨海默症大鼠的学习记忆[J].神经解剖学杂志，2019，35（5）：528-534.

[14] 徐梦颖，邱颐.脑源性神经营养因子在神经退行性疾病中的作用[J].内蒙古医学杂志，2021，53（5）：550-554.

[15] 李越峰，司昕蕾，牛江涛.脑源性神经营养因子及其酪氨酸激酶受体B信号通路在神经性疾病研究进展[J].中国临床药理学杂志，2021，37（9）：1121-1125.

（收稿日期：2021-06-08）