食源性致病菌快速检测技术研究进展

王丹丹，刘鸣畅，杨艳歌，王洪越，袁 飞，吴亚君,*，吴淑清*

（1.长春大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130022；2.中国检验检疫科学研究院，北京 100176）

近年来，随着食源性疾病的暴发，食源性致病菌成为影响食品质量与安全的首要因素，食源性致病菌主要包括弯曲杆菌属、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌、大肠杆菌O157:H7和其他产志贺毒素的大肠杆菌菌株和弧菌等[1-3]。食品从原材料生产到最终消费都可能通过与水、空气、土壤、肥料及食品加工环境的接触而被病原体污染。据市场监督管理总局2020年7月29日发布的食品监督抽检结果可以看出微生物污染占检测不合格项目总数的18.78%，是导致食品安全隐患的主要问题之一。

因此，为了确保食品安全，在将食品投放市场之前，使用可靠、有效的方法检测病原菌至关重要。但是由于近些年食品中添加剂、抗生素等的使用，检测过程中细菌的生长可能受到抑制，传统检测方法容易出现假阴性结果，在对一些表型变异的菌株也较难用形态学辨别其种类，且传统检测方法一般包括前增菌、选择性富集培养、鉴别性培养、挑选特定表型菌株、生理生化鉴定5 个步骤[4-5]，操作步骤繁琐、耗时耗力，无法满足快速检测和预警的需求，因而简便、特异、灵敏、低耗且适用的快速诊断及检测食品中致病微生物的方法被广泛应用。近年来，食源性致病菌快速检测技术获得了很大的进展，本文就目前常用微生物快速检测技术的应用和研究现状作总结概述，以期对我国食品快速检测领域的发展提供参考。

1 食源性致病菌快速检测技术的分类

1.1 显色培养基技术

定位显色培养基是一种基于生化反应的微生物鉴定技术，其原理是根据不同微生物胞内酶反应条件的差异作为分类鉴定的依据，在分离培养基中加入特定的底物，这些底物由微生物可代谢的物质及发色基团组成，在微生物特异性酶的作用下，发色基团游离并显色，通过观察菌落的颜色就能够对菌种进行鉴别[6]。刘成文等[7]用定位显色培养基对单核细胞增生李斯特菌纯培养物及人工污染样品进行了快速鉴定，结果显示该方法对单核细胞增生李斯特菌纯菌及6 份阳性人工污染样品在1∶103～1∶108稀释度下检出率都达到了100%，特异性、灵敏度和准确性较高。结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂培养基（violet red bile glucose agar，VRBGE）被用作阪崎肠杆菌的显色培养，在反应过程中释放糖苷配基5-溴-4-氯-吲哚，该糖苷配基在氧气存在时形成色素溴-氯-吲哚，使菌落呈现蓝绿色。胰蛋白胨大豆琼脂（tryptone soya agar，TSA）是微生物实验中的一种通用营养培养基，如大肠埃希氏菌在该培养基上显示无色透明大菌落，铜绿假单胞菌在该培养基上产生绿色色素，枯草芽孢杆菌则呈现白色不规则菌落[8]。该技术操作简单、方便，但是因为一些竞争作用的存在可能会使目标菌生长受到抑制，产生假阴性结果。

1.2 ATP发光法

ATP发光法是一种快速且便捷的操作技术，只需要几分钟便可以得到检测结果。ATP在细胞代谢中起重要作用，其含量可以直接代表活细胞数，原理是将细菌中的ATP提取出来，和荧光素酶、氧气、镁一同和虫荧光素发生反应产生荧光，通过反应产生的荧光推测计算其ATP的含量，从而得到所测样品中细菌的含量[9-10]。目前，ATP发光技术在大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等致病菌的检测中得到了应用。李海月等[11]通过运用ATP发光技术与平板计数法建立了副溶血性弧菌等常见食源性致病菌的菌落浓度与其相对应的发光强度的数学模型，Park[12]、Minikh[13]、陈文玲[14]等用该技术检测大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等常见食源性致病菌，Bottari等[15]还将该技术用于检测饮料中的菌落总数。但是该检测方法也存在一些不足之处，ATP发光法的检测限较高，且容易受盐、游离ATP、体细胞等因素的干扰[16]，且该反应体系中的酶比较多，酶促反应会相互干扰，导致检测结果不稳定，所以其应用较为局限，目前大多用在水质检测或者食品生产环境的监测。

1.3 免疫学技术

基于抗原抗体结合的免疫学技术也被应用于微生物的快速检测中，这些检测主要依赖于特异性结合抗原的抗体来检测是否含有目标物质，目前应用较多的主要有以下几种技术。

1.3.1 酶联免疫吸附试验技术

酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）技术是用酶标记表面吸附抗原或抗体的固相载体，其与相应的抗体或者抗原相结合，形成带有酶标记的复合物，得到的携带酶的复合物可与特定底物反应产生颜色变化，通过对该产物的定量分析，从而达到检测目的，抗体是确定ELISA灵敏度和特异性的关键因素。Cho等[17]使用3 种抗体功能化的金纳米颗粒进行ELISA分析，因金纳米颗粒具有网络结构，可使更多的酶标抗体连接至靶标，从而增强了信号强度，并且结合免疫磁分离技术，使得对大肠杆菌O157:H7的检测限达到了3 CFU/mL。Wu Wenhe等[18]开发了一种基于金纳米颗粒的酶联抗体-适配体夹心法检测鼠伤寒沙门氏菌，该方法使用适配体功能化的磁珠进行目标分离，用二抗形成夹心结构，并用与检测抗体和酶偶联的AuNPs进行标记，可检测到牛奶中加标浓度为103CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌。ELISA技术检测微生物时特异性较强、灵敏度高、检测时间较短，但其实验过程繁琐，结果重复性较差，且基于单克隆抗体的ELISA检测方法在检测过程中因单克隆抗体易与菌株之间产生交叉反应，导致结果偏差[19]。

1.3.2 免疫荧光技术

免疫荧光技术是采用荧光素标记已知抗原或抗体，与特异抗体或者抗原结合后产生荧光的原理实现检测目标致病菌的目的。Ozeh等[20]将免疫荧光技术与光电动力学技术相结合用于水中大肠杆菌的检测和定量，并在4 h内检测限达到104CFU/mL。较传统ELISA而言，该技术检测时间更短，灵敏度更高。但该技术判定结果的操作过程较繁琐，且需要专业人员操作，因此在食源性病原菌检测方面应用较少。

1.3.3 胶体金免疫层析技术

胶体金免疫层析技术（gold immunochromatography assay，GICA）是以胶体金作为标记物检测特定抗原或抗体的免疫标记技术，其以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，待测物受体与样品反应，产物被聚集到层析材料的某一位置，通过胶体金可直接观察实验现象[21]。彭喆等[22]研制了胶体金免疫层析试纸条对沙门氏菌进行检测，结果表明该试纸条特异性强、重复性好及结果稳定，对沙门氏菌的最低检测量为1.07×107CFU/mL，检测时间仅需5～10 min。刘景武等[23]以胶体金标记沙门氏菌血清抗体，检测沙门氏菌及其他菌种，结果显示21 株沙门氏菌均呈阳性，其他菌株均呈阴性，灵敏度为106CFU/mL，检测时间为10 min。GICA技术还被用来检测大肠杆菌O157:H7[24]以及志贺氏菌[25]等常见微生物。GICA技术操作简单、生产成本低、检测范围广，不需要仪器设备检测，检测速度快，一般在5～15 min就可以得到结果，但是在检测灵敏度和选择性方面较差，因此其应用受到了限制[26]。

1.4 分子生物学技术

1.4.1 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测技术中实时荧光PCR和多重PCR技术在快速检测中的应用比较广泛，其中实时荧光PCR技术是在PCR反应体系中加入了荧光基团，在反应过程中随着荧光信号的积累来实时监测PCR反应进程，最后通过标准曲线来定量分析样品中的待测成分。相比于传统PCR技术，实时荧光定量PCR技术能实现实时对待检成分进行定性、定量分析，省去电泳步骤，节省了时间[27]。周敏琪[28]采用实时荧光定量PCR检测奶粉中的阪崎肠杆菌，结果显示对人工污染的奶粉检出限达到4.7×103CFU/mL。Delibato等[29]应用实时荧光定量PCR检测沙门氏菌，在猪肉基质中检测限达10 CFU/25 g。本课题组也建立了克罗诺杆菌属一步法提取DNA和快速实时荧光PCR速测体系，对于建立的一步法DNA快速提取流程，取样后仅需12 min热循环反应即可直接获取DNA，快速实时荧光PCR仅需27 min即可完成，且该速测体系与传统标准检测方法的灵敏度基本一致[30]。多重荧光定量PCR技术（multiplex quantitative real-time PCR，m-qPCR）是指在同一PCR反应体系里加入两对及两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，较单重PCR反应，该方法可在同一反应管内同时检出多个待检成分，节省时间、试剂和经费，具有高效性、系统性和经济简便性[31-32]。Lee等[33]建立了m-qPCR检测食品中大肠杆菌O157:H7、蜡状芽孢杆菌、副溶血性杆菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌以及金黄色葡萄球菌的方法，该m-qPCR分析方法用于评估人工接种的几个即食食品样品中6 种食源性病原体的检测有效性时，在12 h内对6 种目标菌的检测限能达到1 CFU/mL。PCR检测技术是以核酸为基础的检测技术，基于核酸的检测方法速度快、特异性高及重现性好，并且只需要少量的靶标DNA，但由于活细胞和非活细胞都存在核酸物质，仅凭核酸无法直接区分活菌和死菌，对此，一些研究者开发了仅检测活细菌DNA的PCR检测方法，Li Baoguang等[34]研究将定量PCR（quantitative PCR，qPCR）与叠氮化丙锭（propidium monoazide，PMA）结合使用，抑制了死细胞的DNA扩增，从而仅检测活菌DNA，该技术能够检测菠菜中10～103CFU/g活细胞。此外，数字PCR（digital PCR，dPCR）是继普通PCR和实时荧光定量PCR之后的第三代PCR技术，是一种具有单分子敏感性的精确核酸定量技术[35]。dPCR以微流控和微滴化为基础，将大量稀释后的核酸分散至数百到数万计的微滴中，每个反应室中的单拷贝核酸进行独立的荧光PCR扩增，通过逐个检测并统计反应室中阳性和阴性反应的数量单元，最终计算出初始样品中目标核酸的精确拷贝数。相对于传统PCR技术而言，dPCR不依赖扩增阈值和标准曲线，具有高灵敏度、高精确度和绝对定量等特点[36-37]。赵新等[38]采用微滴式dPCR技术定量检测沙门氏菌，检测灵敏度可达102CFU/mL，目前已经有多种食源性致病细菌，如大肠杆菌、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌等均建立有dPCR检测方法[39-40]。

1.4.2 等温扩增技术

1.4.2.1 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermalamplification，LAMP）是针对靶基因的6 个区域设计4 种特异引物，在链置换DNA聚合酶、60～65 ℃恒温条件下在体外扩增核酸的技术[41]。王瑾[42]根据沙门氏菌invA基因序列设计了特异性引物，建立了沙门氏菌LAMP检测方法，该方法检测仅需45 min，灵敏度达到6 CFU/mL。LAMP技术也被运用到创伤弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌的检测[43-45]。同时，为满足各种需求，新型的LAMP分析方法也得到发展。Liu Ningwei等[46]开发了基于不同熔融温度的多重LAMP测定法，以同时鉴定沙门氏菌和副溶血性弧菌，结果显示该方法具有100%的特异性。Wu Guoping等[47]开发了一种叠氮溴化乙锭结合实时荧光环介导等温扩增（ethidium monoazide bromide-real-time-loop-mediated isothermal amplification，EMA-Rti-LAMP）法测定，使用实时LAMP方法结合叠氮溴化乙锭（ethidium monoazide bromide，EMA）处理来选择性检测和定量肠炎沙门氏菌的活细胞。该技术特异性高、反应速度快、敏感性高、简单便捷及成本低[48]。但该方法也存在一些缺点，如LAMP法的引物比PCR方法的引物要求更高，设计符合要求的引物较难，且该反应过程中加入多条引物，引物间可能会因碱基互补产生二聚体，进而导致产生假阳性结果[49]。

1.4.2.2 重组酶聚合酶扩增技术

重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA）是另一种新颖的等温扩增技术，由特定的重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶结合，在常温条件下进行反应，5～20 min即可获得与LAMP一样的检测结果。Yang Huanla等[50]使用重组酶聚合酶和内部扩增对照（internal amplification control，IAC）的新型RPA-IAC测定法来检测副溶血性弧菌，根据副溶血弧菌toxR基因的编码序列设计特异性引物，竞争性IAC与目标序列同时扩增，以避免假阴性结果，检测灵敏度达3×103CFU/mL。Chen Jiaping等[51]开发了一种基于荧光探针的RPA分析方法用于肠炎沙门氏菌检测，检测限可达2.2×103CFU/mL。RPA灵敏度高、操作简单、检测效率高，并且其所需试剂大多都以干粉形式保存，方便运输且能够长期保存，但是，RPA扩增反应需要的引物长度为30～35 bp，比PCR引物更长，因此引物序列优化时间冗长。此外，RPA通常在扩增后需要纯化，否则在琼脂糖凝胶电泳时会导致结果模糊。

1.4.2.3 滚环扩增技术

滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）技术是DNA分子以滚环式复制的一种恒温扩增技术，其关键在于构建一个完整的单链DNA环用于后续扩增，RCA主要有线性RCA、超分支RCA和多引物RCA。Hao Liling等[52]设计了金黄色葡萄球菌的RCA反应，反应中产生的单链DNA用于捕获反应中形成的游离复合物，从而较少量的复合物吸附在纳米材料上，保持原有化学发光，实现信号放大，结果表明在最优条件下该方法对纯培养的金黄色葡萄球菌的检测限可达15 CFU/mL。Takahashi等[53]建立了一种基于RNA引导的RCA技术用于检测单核增生李斯特菌，通过分子内连接制备预环化的DNA探针，并用核酸外切酶I处理以消除未环化的寡核苷酸，从而显著降低影响RNA引导的RCA的非特异性扩增DNA副产物。RCA反应在设计上较简单，不像LAMP一样需要多个引物，反应产物较单一，能与探针直接结合实现信号放大。但RCA操作繁琐，需要磷酸化的DNA来构建环，此过程需要的DNA连接酶对反应体系要求较高，当体系中的NaCl或KCl的浓度超过200 mmol/L时，DNA连接酶的活性会被抑制。

1.4.3 基因芯片技术

基因芯片技术（DNA chip）又称DNA芯片、DNA微阵列技术，其主要利用核酸分子杂交，是通过基因芯片上固定的已知序列的核酸或核酸片段去确定被检测的DNA样品，因其通量高、自动化程度高等被广泛应用在各个领域。左秀华[54]将多重PCR技术与基因芯片技术结合检测致泻性大肠杆菌，其对肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌和大肠杆菌O157特异性较好，检测的灵敏度为104CFU/mL。顾鸣等[55]将基因芯片技术与PCR技术联用检测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，其检测限分别可达1.0×101CFU/mL和1.0×102CFU/mL。基因芯片技术因操作简便快捷、通量高从而实现快速检测，但该方法所需要的仪器费用较高，检测特性较差，且操作过程中待检物质在放大时易污染，导致结果偏差。

1.4.4 微流控芯片技术

微流控芯片技术（microfluidic chip）又称为芯片实验室，结合分析化学、微机电加工技术、微管道网络、生命科学等多个技术，其将样品制备、反应、分离、检测等多个步骤集成到一张芯片上，较基因芯片大多只能使用一次而言，微流控芯片能够多次使用，因此更有发展前景。其通常借助光学方法或荧光信号检测将扩增的DNA可视化，Park等[56]开发了一种利用mPCR的微流控芯片设备来检测大肠杆菌O157:H7，该测定法使用集成的无泵微流控芯片，通过PCR在膜室中扩增食源性病原体的靶基因，并使用方波伏安法对扩增的基因进行电化学定量，其灵敏度可达102CFU/mL。Zhu Tao等[57]将电化学阻抗技术结合微流控芯片检测大肠埃希氏菌，在2 h内其检测限可达103CFU/mL。微流控芯片技术检测时所需的样本和试剂用量少，并且在微流控芯片内集成多条通道提高了检测通量，但由于各通道间都是独立的，因此集成度不高，且各个通道需进行单独操作，各反应通道间的平行性无法保证[58-59]。

1.4.5 高通量测序技术

二代测序技术实现了对全基因组的研究，把DNA测序引入到高通量测序时代，但是二代测序技术读长过短、易引入PCR扩增错误且具有碱基GC偏好性，因此三代测序应用而生，与二代测序的边合成边测序相比，三代测序不需要进行PCR扩增，避免PCR扩增引入错误，同时第三代测序具有更高的通量和测序效率[60]。Sarah等[61]利用MinION纳米孔测序仪进行了微生物基因组测序，结果表明该测序仪可以在国际空间站上进行快速的现场诊断和微生物鉴定，并且可以在任何空间环境中进行大规模的微生物鉴定。Ji Bin等[62]使用PacBio测序平台对两个典型的废水处理厂细菌菌群进行了研究，发现变形细菌和拟杆菌属占两个废水处理厂的50%以上，该平台可鉴定属水平上总序列的68%。三代测序做到了高通量、长读长，其能够降低基因组拼接的成本，节省计算的内存和时间，在原理上也避免了PCR的扩增错误，同时可以直接应用在RNA测序、DNA甲基化等研究上。然而三代测序仍存在一些重要限制因素如成本高、碱基错误率高、实验依赖DNA聚合酶的活性和生物信息软件不够丰富等。

1.5 生物传感器技术

生物传感器是由生物感受器和换能器两大部分组成的分析装置，检测微生物时主要利用抗原（抗体）以及各种敏感酶、生物碱和基因序列等，若待测样品与以上物质反应，便会产生生物相互作用，随后信号转换器可将其转化为一些可测量的电信号，再由信号放大器进行读取检测[63]。通常用于快速检测食源性病原体的生物传感器有光学生物传感器、电化学生物传感器以及机械生物传感器[64-65]。Izadi等[66]建立了一种基于DNA的金纳米粒子改性的电化学生物传感器来检测蜡状芽孢杆菌，生物传感器的传感元件由金纳米颗粒和自组装的nheA基因的单链DNA组成，其通过与靶DNA杂交而产生的生物传感器，增加其电荷转移阻力来进行蜡状芽孢杆菌的检测，该传感器可以特异地从乳制品中检测蜡状芽孢杆菌的目标DNA序列。Song Yang等[67]研制了一种基于荧光共振能量转移的生物传感器来检测肠炎沙门氏菌16S rRNA，对肠炎沙门氏菌的检测限可达102CFU/mL。Kanayeva等[68]采用电化学生物传感器可检测生菜、牛奶、碎牛肉中的单核细胞增生李斯特氏菌，此研究中单核细胞增生性抗体通过生物素-链霉亲和素键变成免疫磁性纳米颗粒，以在2 h的免疫反应中捕获样品中的单核细胞增生李斯特菌。

生物传感器技术检测微生物具有快速、灵敏、操作简单和对操作人员要求低等特点，但生物传感器的应用也存在一些问题，病原体对每种基质的吸附方式不同，矩阵相关的可变性测量会导致目标菌的电容信号下降，还有些复杂食品基质因所含丰富蛋白质、脂肪等高密度成分，导致传感器共振频率降低，还有一些非致病菌的存在阻碍目标病原体向传感器表面靠近，也会干扰致病菌的检出，所以食物基质的复杂性限制了其灵敏度和特异性[69-71]，加上生物传感器用于识别生物分子的原件其寿命相对较短，生产成本也比较高[72-74]，所以生物传感器技术的使用受到了一定的限制，大多还处于研制阶段。

1.6 流式细胞技术

流式细胞技术（flow cytometry，FCM）是基于细胞直接计数的一种微生物快速检测方法，流式细胞计数装置一般包括液流系统、光学系统、信号收集与转换系统、分析系统[75-76]。其使用激光对通过激光束的颗粒进行计数，从而实现细胞的定量观察和定性分析，当颗粒或者细胞通过激光束的时候，会对光线产生折射和反射，此信号被探测器记录下来，每通过一个细胞，就会产生一个峰值，最后根据峰值的个数得到细胞的数值[77]。FCM对食品中的活菌数直接进行检测，速度快，无需增菌，可在90～100 min内出具检测结果；灵敏度高，甚至可检测出1 个活的微生物或活细胞；该检测技术适用于水、液态加工食品、饮料、化妆品及药品等行业[78-80]。刘道亮等[81]利用FCM能够实现在100 min内对液态商品中的细菌总数进行实时、自动化检测，检测限达到101CFU/mL数量级。

流式细胞计数法因其高通量以及能够识别细胞的死活，被应用在工厂等检测领域。但是流式细胞技术在检测时需要对样品进行稀释，其灵敏度会在一定程度上降低，常需要与传感器技术等一起被联合使用，且检测过程中加入大量的荧光基团，使得后期的分析过程复杂，因此其应用受到限制[82]。

1.7 光谱技术

随着光学仪器、光学技术以及计算机技术的快速发展，光谱检测技术得以快速发展，拉曼光谱[83-84]技术和表面增强拉曼光谱技术、傅里叶变换红外光谱技术被广泛用于微生物的快速检测。拉曼光谱技术是通过测定代谢分子反应物质分子内部化学键的情况，从而确定微生物的种类。Meisel等[85]证明了拉曼光谱法适用于检测牛奶和肉制品中微生物单细胞水平的检测，检测限为103～109CFU/mL。de Plano等[86]使用拉曼光谱技术检测金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌。还有将光谱技术与纳米阵列相结合，制备表面增强拉曼光谱以提高其检测能力[87-88]。傅里叶变换红外光谱技术被用来检测微生物是因为其可识别菌体细胞壁、细胞膜以及细胞内肽聚糖、磷脂双分子层、蛋白质、核酸等成分化学键的振动情况，从而达到检测微生物的目的，Davis等[89]使用傅里叶变换红外光谱技术对大肠杆菌进行了检测，Argyri等[90]还将傅里叶变换红外光谱技术用于检测变质牛肉片的菌落总数。

光谱检测技术是一种新兴的无损检测技术，其具有检测快速、安全高效、样本需要量少和自动化程度高等优点，但同时也存在一些问题，虽然拉曼光谱检测微生物预处理步骤简单，对菌体无损伤，但其图像易受微生物生长环境、生长状态以及样本制作过程等因素的影响，且其检测波长和样品处理方式都不统一。傅里叶变换红外光谱技术检测微生物时对样品的水分含量要求较高，样品中应该尽量无水分，因为水分会影响样品吸收峰的检测。因此光谱技术还需要不断发展来更好的应用在微生物的检测领域。

1.8 质谱鉴定技术

质谱技术是一种根据离子产生的质量图谱来确定样品中分子组成的分析技术。质谱技术不仅可以对传统的目标分析物进行定性和定量分析，还可以用于细菌的快速准确鉴定[91]。在微生物的分析中，通过单个质量峰对微生物进行鉴定，从而实现微生物鉴定的快速性和有效性，其检测过程高度自动化，极大加强了其简便性与应用广泛性。微生物检测常用的质谱技术主要包括气相色谱-质谱联用技术（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）、液相色谱-质谱联用技术（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）、基质辅助激光解吸飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOFMS）及电喷雾质谱（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）等。Lau等[92]采用MALDITOFMS技术建立了真菌数据库，涵盖了76 种菌属、152 个种类、294 个独立菌株，并对421 株真菌的鉴定准确率达到了88.9%。Krishnamurthy等[93]利用蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌各自特有的蛋白质作为标志物，采用高效液相色谱-质谱联用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）鉴定了9 种不同种属的细菌。其中，GC-MS技术主要用于分析微生物中的脂肪酸、糖类等小分子物质，MALDI-TOFMS技术对微生物检测中，一般通过参考细菌图谱对细菌的种类进行鉴定，此种方法适合大部分的细菌物种[94]，ESI-MS技术主要是通过分析蛋白质、脂质、核酸等大分子物质来鉴定微生物，完成对不同属、种的区分[95]。

质谱技术在微生物检验中的应用具有明显的优势，对样品的要求很低，样品可以不进行分离纯化，直接进行测样，该方法准确性高、操作简单、可自动化，同时还具有高灵敏度、高通量、高特异性，所以在微生物检测中得到快速发展[96]。但经研究，该方法也具有一定的缺陷，其对结构较特殊、罕见的菌种、新型的菌种、混合菌等检测较困难[97]。

食源性致病菌快速检测技术主要包括上文所提到的几种技术，其具体应用信息见表1。

表1 食源性致病菌检测技术Table 1 Detection technologies for foodborne pathogens

2 结 语

近年来，已开发出许多检测食源性病原体的方法，以解决食品安全和公共卫生问题，特别是随着对新鲜食品和短保质期食品的食用不断增加，快速检测技术更具市场，众多学者在不同快速检测技术上都不断革新，在检测时间、灵敏度以及准确度上都有了很大的提升，但也还存在着不足，需要国内外研究者不断地完善和改进现有的检测技术。一方面，几乎所有的快速检测技术都存在灵敏度不足的缺点，因此还需富集、培养等过程才可以得到检测结果，免疫磁分离技术是一种经常被用在前处理过程中以提高检测灵敏度的技术，其已成功用于富集和分离多种病原体，可以有效消除样品基质中的聚合酶抑制剂，从而在检测致病菌时缩短了富集时间并提高了灵敏度。快速检测技术发展的方向应符合食品安全检测的要求，实现高精度、高效率、低成本方式在线监测病原体。另一方面，人工智能、基因编辑、纳米技术等前沿学科融入到食源性致病菌的快速检测，也将成为未来的发展趋势。同时，在检测过程中，还可以根据检测要求选择适当的技术，并且可以尝试将未来多学科交叉结合使用，发挥各学科的优势，并实现优势互补，从而提高检测的灵敏度、增加检测准确性、缩短检测时间。另外，国内现行的标准几乎没有针对食源性致病菌快速检测的方法，无法满足检测和监管的需求，因此还亟待制定一系列快速检测技术的国家标准、行业标准、地方标准等，弥补快速检测标准缺乏的现状。

我国对食品安全快速检测越来越重视，国务院印发的“十三五”国家食品安全规划中“加快建设食品安全检验检测体系”中强调了要加强食品快速检测方法应用及评价的要求，新修订的《中华人民共和国食品安全法》更是为食品检测技术提供支持和保障，因此，食源性致病菌的快速检测技术有着广阔的应用前景。随着科学技术的发展，仪器便携化、智能化、数字化趋势越来越明显，快速、高效、简单、环境污染小的快速检测方法，是食品快速检测技术的发展趋势。未来，食源性致病菌检测技术会朝着多种检测技术相融合、通量更高、检测速度更快、灵敏度更高、准确性更高、适用性更强、成本更低、可广泛推广和标准化的方向发展，为生产、加工、流通和销售整个生产链的食品安全监管保驾护航。