金针菇蛋白聚糖对脂多糖诱导的Caco-2/RAW264.7细胞共培养模型炎症的抑制作用

苏安祥，胡 烨，胡秋辉，徐 辉，刘建辉，谢旻皓，裴 斐，杨文建*

（南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，江苏 南京 210023）

肠道性炎症包括结肠炎和直肠炎，近年来其发病率不断升高，严重影响人们的身体健康和日常生活。肠道性炎症的产生和发展与饮食结构、精神压力、生活习惯有关[1-2]。从饮食方面入手，筛选有抑制炎症作用的食物成分、调节膳食组成是预防和控制肠道炎症的可行途径。文献报道显示，大蒜素[3-4]、乳铁蛋白[5]、白藜芦醇[6]、人参水溶性膳食纤维[7]、金针菇多糖[8]、蓝莓花色苷[9]、灵芝多糖[10]、松仁多糖[11]、百合多糖[12]等均对肠道炎症有抑制作用。食用菌功能成分的生物活性已被广泛证实[13]，多糖被发现具有可控制病毒感染[14]、增强免疫应答[15]等生物活性功能。灵芝蛋白聚糖作为一种复杂的糖复合物，当其直接作用于癌细胞时或作用于免疫细胞时，可通过刺激细胞释放因子，从而抑制肿瘤细胞的增殖，表现出抗肿瘤活性；而蛋白聚糖作用于免疫细胞时，同样通过抑制一氧化氮（nitrite oxide，NO）的释放，同时抑制细胞释放细胞因子（白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、下调肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）等），达到抗炎效果，有效减缓炎症[16]。本课题组前期对金针菇的功能成分进行了系统的分析研究，阐明了金针菇多糖、金针菇多酚等成分的功能作用[17-19]。本实验通过分离纯化得到金针菇蛋白聚糖（Flarnmulina velutipesproteoglycans，FPG）1-1，拟从细胞水平探讨其对肠道炎症的生物活性。

Caco-2细胞来源于人结肠腺癌细胞，具有微绒毛结构，能够生产小肠刷状缘上皮相关的酶，细胞培养成熟后可形成完整的细胞单层膜，其结构和功能类似于小肠上皮细胞，是国际上公认的研究小肠上皮细胞吸收和转运等功能的最佳模型之一[20]。Caco-2细胞容易在体外培养，稳定性好，实验重现性高，与动物实验相比具有容易操作、耗费时间少、需要的样品量小等优点，被广泛应用于体外活性快速筛选、肠道相关问题的科学研究[21]。但是仅用Caco-2细胞难以有效模拟体内微环境，特别是细胞与细胞之间的相互作用。近年来研究发现，肠上皮细胞与免疫细胞之间具有精细的对话机制，肠上皮细胞通过信号传导调节免疫细胞细胞因子等物质的分泌，从而改善肠道健康[22]。Caco-2细胞和免疫细胞（巨噬细胞RAW264.7）共培养技术可以弥补Caco-2细胞单培养在模拟体内微环境上的不足，有助于系统探讨生物活性物质对肠道上皮细胞的屏障作用、肠黏膜上皮细胞与免疫细胞的对话机制[22]。

本实验以来源于金针菇的蛋白聚糖为原料，建立脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的Caco-2细胞、巨噬细胞RAW264.7共培养炎症模型，测定NO、活性氧（reactive oxygen species，ROS）及细胞因子水平等指标，以分析FPG1-1对炎症抑制的作用，为金针菇功能成分的开发和利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

FPG1-1根据文献报道方法[23]分离纯化获得。人克隆结肠腺癌细胞（Caco-2）和小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）购于复旦大学生物医学研究院细胞资源中心。

LPS、DMEM高糖培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗溶液、胰蛋白酶 美国Gibco生物科技公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）、四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、NO、ROS等试剂盒 碧云天生物技术研究所；IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10等酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒 南京建成生物工程生物研究所。

1.2 仪器与设备

生物安全柜、8000系列二氧化碳细胞培养箱、超低温冰箱、Barnstead GenPure xCAD超纯水仪 美国Thermo Fisher公司；酶标仪 美国Molecular Devices公司；倒置式生物显微镜 北京Precise仪器有限公司；高压灭菌锅 日本Tomy Koqyo公司；RES-2电阻仪德国Millicell公司；DM2500 LED荧光显微镜 德国Leica公司；FACSCalibur流式细胞仪 美国Becton Dickinson公司；Transwell培养皿 美国Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

由10%胎牛血清、0.5%青链霉素与DMEM配制细胞培养液，将Caco-2或RAW264.7细胞接种至含完全培养液T25细胞培养瓶中，置于细胞培养箱中培养（37 ℃、5% CO2）。当细胞增殖至80%时进行传代，用3 mL PBS洗涤两次。加入3 mL培养液并吹打细胞，使其脱落，转移至15 mL离心管中，离心（37 ℃、1 000 r/min、5 min），去除上清，加1 mL完全培养液吹打成细胞悬浮液。吸取0.5 mL细胞悬液加入到T25培养瓶，然后加10 mL完全培养液，于恒温培养箱中培养[24]。

1.3.2 细胞增殖率的测定

使用MTT法测定FPG1-1对RAW264.7的细胞毒性作用。RAW264.7细胞在96 孔板中37 ℃孵育24 h后，用PBS洗涤数次。对照组（含RAW264.7细胞）和空白组（不含RAW264.7细胞）分别加入200 μL DMEM，各处理组加入等体积不同质量浓度（25、50、75、100、150、200 μg/mL）的样品，每组设置6 个平行，孵育24 h后，加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL）并在37 ℃培养基中孵育4 h。去除MTT溶液后每孔加入100 μL DMSO。将96 孔板置于恒温振荡器上室温振荡20 min后，测定波长570 nm处吸光度，按照式（1）计算细胞增殖率。

式中：A1表示处理组吸光度；A2表示对照组吸光度；A0表示空白组吸光度。

1.3.3 Caco-2细胞单层细胞模型的建立

培养的Caco-2细胞消化离心后制备细胞悬浮液，按照Transwell实验使用方法，在Transwell小室和下室中均加入培养基，Caco-2细胞接种于Transwell小室，使细胞终浓度为2.5×105个/mL，第一周每2 d更换一次Transwell小室和下室细胞培养基，第2、3周每天更换培养基[24]。以跨膜电阻（trans-epithelial electrical resistance，TEER）和细胞形态评估单层细胞的形成情况，步骤参照方法1.3.4节和1.3.5节。

1.3.4 Caco-2细胞单层细胞模型跨膜电阻的测定

Caco-2细胞单层跨膜电阻值（trans-epithelial electrical resistance，TEER）采用电阻仪每天测定电阻，并根据公式（2）计算TEER。其中空白组为未接种细胞的孔，样品组为接种细胞的孔。

式中：Rs为样品组的电阻值/Ω；Ra为空白组的电阻值/Ω；S为孔板的膜面积/cm2。

1.3.5 细胞形态学观察

使用倒置光学显微镜观察细胞形态并拍照。

1.3.6 Caco-2细胞和RAW264.7巨噬细胞共培养模型建立

参考文献[25]的方法并稍作修改。通过形态学观察，Caco-2细胞单层细胞模型培养合格后，去除下室培养液，PBS清洗3 次，将培养的RAW264.7巨噬细胞悬液接种于下室，加入培养基使下室RAW264.7巨噬细胞密度为1×105个/mL。

实验分组：对照组小室和下室以无血清培养基孵育；模型组小室加入无血清培养基，下室加入LPS，使其质量浓度为10 μg/mL；蛋白聚糖处理组下室加入LPS（终质量浓度10 μg/mL）处理4 h后，小室分别加入终质量浓度25、50、100、200 μg/mL的蛋白聚糖，孵育12 h。每组样品设置5 个平行实验。

1.3.7 NO浓度的测定

按照NO试剂盒操作说明进行测定。根据公式（3）计算NO含量。

式中：An为样品组吸光度；A0为空白组吸光度；A为标准品组吸光度；c为标准品浓度（100 μmol/L）；N为样品测试前稀释倍数。

1.3.8 ROS相对水平的测定

参考文献[26]报道的方法，利用二氯荧光乙酰乙酸盐（dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）荧光探针法检测细胞ROS水平。按照ROS测试试剂盒说明书进行操作，流式细胞仪检测荧光强度，并根据公式（4）计算ROS相对水平。

式中：Bn为各处理组荧光强度值；B0对照组荧光强度值。

1.3.9 细胞因子质量浓度的测定

按照ELISA试剂盒操作说明，测定IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10细胞因子质量浓度。

1.4 数据统计分析

数据结果以平均值±标准差表示，采用SPSS软件对实验数据进行统计分析，以One-Way ANOVA进行显著性分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 FPG1-1对巨噬细胞RAW264.7增殖的影响

采用MTT法研究FPG1-1对巨噬细胞活力的影响。细胞增殖率可用来反映细胞生长分裂情况，常用来指示样品对细胞活性的影响，以确定适用于细胞实验的样品质量浓度。定义对照组测得的细胞增殖率为100%，测得质量浓度为25、50、75、100、150、200 μg/mL的FPG1-1样品处理后的细胞增殖率分别为（96.13±2.47）%、（91.34±2.19）%、（90.01±2.06）%、（91.65±3.24）%、（89.74±4.79）%和（88.26±2.21）%，增殖率均高于80%，这些质量浓度远高于半数抑制质量浓度（half-maximal inhibitory concerntration，IC50），但是FPG1-1质量浓度为200 μg/mL时，细胞增殖率显著降低（P＜0.05）（图1）。由此可知当FPG1-1处理浓度低于200 μg/mL时，对小鼠巨噬细胞活性无显著影响且毒性作用低，可用于细胞实验。为了保证所选的样品质量浓度范围大，同时减少实验组数，因此选取FPG1-1质量浓度25、50、100、200 μg/mL作为样品处理质量浓度进行后续研究。

图1 FPG1-1对RAW264.7细胞增殖率的影响Fig.1 Effect of FPG1-1 on viability of RAW264.7 cells

2.2 Caco-2细胞单层细胞模型的建立

Caco-2细胞结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，其结构与人小肠上皮细胞类似，可用作肠道转运模型[27-28]。培养过程Caco-2细胞单层细胞模型TEER的变化如图2所示，TEER是一种反映Caco-2细胞单层完整性的指标，TEER与细胞单层通透性呈负相关关系，与细胞单层完整性、致密性呈正相关关系，其变化可以反映细胞单层结构的形成情况，可通过测量Caco-2单层的TEER来判断单层Caco-2细胞的完整性。结果显示TEER整体上呈“S”型增长，Transwell中的Caco-2细胞在培养1～4 d内TEER升高缓慢（低于100 Ω·cm2）；5～11 d内TEER升高迅速；12～15 d内TEER继续升高，但增速降低，该范围内TEER超过400 Ω·cm2，第15天时TEER已在500 Ω·cm2左右。16～22 d，TEER变化不明显，趋于稳定，处于500～550 Ω·cm2范围内，说明15 d时细胞已形成完整的致密单层，单层细胞模型建立成功。此结果与丁涛[29]、余自成[30]等的研究结果一致。

图2 Caco-2细胞单层细胞模型TEERFig.2 Transepithelial electrical resistance (TEER) of Caco-2 cell monolayer model as a function of culture time

结合细胞形态学观察进一步确定单层细胞完整性形成情况，如图3所示，观察不同培养时间下的Caco-2细胞（Transwell小室）形态。Caco-2细胞接种到培养板培养8 d后，贴壁生长的Caco-2细胞繁殖，细胞呈现不规则形状，单细胞层开始逐渐连接形成片状，18 d后细胞结合紧密，已形成完整的细胞单层，此时Caco-2细胞开始出现成熟肠道黏膜上皮细胞的结构特征，此时细胞单层结构完整性好，适于进一步实验。

图3 培养时间对Caco-2单层细胞形态的影响（×20）Fig.3 Effect of culture time on Caco-2 monolayer cell morphology (× 20)

2.3 FPG1-1对巨噬细胞RAW264.7 NO分泌的影响

有研究报道NO参与免疫应答相关的生理过程，是巨噬细胞杀伤病原微生物的主要效应分子之一[31]。NO的分泌水平可以表征细胞状态，巨噬细胞通过释放细胞因子，积极参与炎症反应。如图4所示，LPS处理极显著增加了细胞中NO的生成量，而经FPG1-1处理后细胞中的NO浓度显著降低，并显示出剂量依赖性，NO浓度随着FPG1-1处理质量浓度的升高而下降，200 μg/mL FPG1-1处理后的细胞内NO浓度为（16.23±1.46）μmol/L，极显著低于LPS模型组。由此推测，FPG1-1可能通过抑制NO分泌，保护Caco-2细胞和RAW264.7细胞共培养模型，发挥抗炎作用，这与胡晓祎[22]的研究结果一致。

图4 FPG1-1对RAW264.7细胞中NO生成量的影响Fig.4 Effect of FPG1-1 on NO production in RAW264.7 cells

2.4 FPG1-1对巨噬细胞RAW264.7 ROS生成的影响

ROS包括超氧自由基、其衍生物过氧化氢和羟自由基等，通过检测细胞内ROS水平可以反映生物体氧化损伤的程度。图5为FPG1-1对巨噬细胞RAW264.7 ROS生成的影响。结果显示，LPS处理能显著诱导RAW264.7细胞内ROS生成量提高（P＜0.01），FPG1-1处理会降低细胞内LPS导致的氧化应激产生ROS水平，经过不同质量浓度FPG1-1（25、50、100、200 μg/mL）处理后，细胞内ROS分泌量显著降低（P＜0.05、P＜0.01），并且FPG1-1干预质量浓度越高，ROS水平下降越多。FPG1-1质量浓度为200 μg/mL时，ROS相对水平降至102.68%。有研究报道，ROS促进肠道炎症中的氧化应激，而ROS水平增加与疾病加重和恶化有关，炎性肠病实验中，随着ROS水平增加，内源性抗氧化物质的消耗和氧化应激标志物水平显著增加，过量的ROS引起氧化应激，在体内产生氧化分解产物从而诱发炎症，同时激活炎症细胞去分泌促炎因子，导致氧化损伤[31]。另有研究显示，ROS水平与细胞增殖密切相关，当ROS浓度过高时，会诱导细胞发生氧化应激反应，从而造成氧化损伤[32]。结合实验结果可知，FPG1-1能够有效降低ROS的产生，避免氧化应激，从而缓解细胞炎症。

图5 FPG1-1对RAW264.7细胞中ROS生成量的影响Fig.5 Effect of FPG1-1 on ROS production by RAW264.7 cells

2.5 FPG1-1对RAW264.7细胞因子水平的影响

为了研究FPG1-1对细胞炎症抑制作用是否是通过调控细胞因子的分泌水平而实现，将不同质量浓度FPG1-1（25、50、100、200 μg/mL）作用于Caco-2细胞与RAW264.7细胞共培养模型，通过ELISA法测定细胞培养液中各细胞因子的水平。不同质量浓度的FPG1-1对细胞的IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10质量浓度的影响如图6所示。经过25、50、100、200 μg/mL FPG1-1处理后，IL-6质量浓度分别为（10.46±1.01）、（10.12±0.90）、（8.88±1.32）、（8.48±0.31）ng/mL，模型组为（14.45±1.12）ng/mL，对照组为（9.93±1.34）ng/mL，FPG1-1处理组与模型组IL-6质量浓度有显著性差异（P＜0.05），说明FPG1-1能显著抑制炎症因子IL-6的分泌。对于IL-10而言，25、50、100、200 μg/mL FPG1-1处理后其质量浓度分别为（189.75±4.62）、（221.40±18.39）、（290.36±36.14）、（329.15±25.12）ng/mL，模型组为（154.92±10.32）ng/mL，说明高质量浓度FPG1-1能有效促进抗炎细胞因子IL-10释放。同时，与模型组相比，FPG1-1处理显著降低IL-1β分泌（P＜0.05），极显著降低TNF-α的生成量（P＜0.01）。研究显示，免疫细胞在肠炎过程中分泌过量的促炎因子是肠道炎症发展的重要因素之一，某些生物活性成分可抑制LPS诱导的小鼠细胞产生TNF-α，间接抑制IL-1β的合成表达，并抑制促炎细胞因子（如IL-6）的过度分泌，促进抗炎性细胞因子（IL-10）产生，从而缓解炎症[33]。以上结果表明，FPG1-1的抗炎作用与抑制促炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6分泌和提高抗炎细胞因子IL-10分泌有关。

图6 FPG1-1对RAW264.7细胞因子含量的影响Fig.6 Effect of FPG1-1 on cytokine secretion by RAW264.7 cells

3 结 论

本研究建立了Caco-2细胞和RAW264.7细胞共培养肠炎模型，分析FPG1-1的抗炎作用。利用NO释放量表征巨噬细胞的炎症活化状态，与模型组相比，FPG1-1处理显著降低了细胞NO、ROS水平（P＜0.05、P＜0.01），表明FPG1-1可显著抑制NO、ROS分泌，保护细胞进而缓解氧化应激。ELISA测定细胞因子水平结果表明FPG1-1能上调IL-10和下调TNF-α、IL-1β、IL-6分泌。以上结果表明，FPG1-1可以作用于肠上皮细胞，通过上皮细胞与免疫细胞之间的相互作用，降低细胞NO、ROS水平，抑制炎症细胞因子的分泌，发挥改善肠道炎症的作用。下一步将通过动物实验深入研究其在体内的作用效果及机制。