胰岛素样生长因子结合蛋白-6在舒尼替尼治疗肾透明细胞癌中的作用*

胡威，祝恒成

(武汉大学人民医院泌尿外科，武汉 430060)

透明细胞癌(clear cell-renal cell carcinoma，ccRCC)是人类泌尿系统三大恶性肿瘤之一，致死率最高，目前外科手术切除原发病灶仍是治疗ccRCC最有效的方法，但ccRCC通过血液转移概率高，手术切除原发病灶后依然存在转移可能[1-4]。对于身体状态差、无法耐受手术患者，或错过手术时机的晚期肾癌患者，或手术切除原发病灶后仍然发生转移的患者，可考虑使用药物治疗。

舒尼替尼(sunitinib，美国辉瑞公司，商品名：索坦)是近10多年来开发出的多靶向抗癌药物，具有强大的抗癌活性[5]，其最初开发目的是针对晚期转移性肾癌，目前已被多个国家和地区医学指南推荐为晚期ccRCC一线治疗药物(如美国、欧盟和中国等)。多项临床研究表明，舒尼替尼作为一线治疗药物，对ccRCC患者无进展生存期及症状缓解率均优于生物制剂α干扰素(interferon-α，IFN-α)等[6-7]，且舒尼替尼不良反应较少，易被控制。胰岛素样生长因子结合蛋白-6(insulin-like growth factor binding protein-6，IGFBP-6)是一个较新的IGFBP家族成员，已有研究表明其在多种肿瘤发生、发展中发挥重要作用[8-9]，IGFBP-6在肾肿瘤中的作用笔者较少见到报道。笔者前期研究已证实，在ccRCC临床标本中，IGFBP-6 mRNA及蛋白表达明显高于对照的癌旁组织，差异有统计学意义，且IGFBP-6表达与患者性别、年龄及肿瘤TNM分期(tumor lymph node metastasis staging，TNM staging)、肿瘤大小、淋巴结转移等因素无相关性[10]。本研究旨在通过体外实验，进一步观察IGFBP-6在ccRCC中的作用，并研究舒尼替尼对ccRCC治疗作用是否与调控IGFBP-6基因表达有关，以进一步探索舒尼替尼药理作用机制。

1 材料与方法

1.1细胞的培养 人正常肾小管上皮细胞株HK-2(批号：21563-29-1)、人ccRCC细胞株786-O(批号：CL-0010)均购于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC)；含10%新生胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的RMPI1640培养基(美国Gibco公司，批号：8117179)，平衡盐DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline，美国Gibco公司，批号：8127186)，胰蛋白酶Trypsin-EDTA (美国Gibco公司，批号：25200-56) 培养于37 ℃温箱。为观察舒尼替尼对786-O细胞株作用，将786-O细胞用舒尼替尼作用0～24 h，确定合适的用于干扰的舒尼替尼 (美国Onyx Pharmaceuticals公司，批号：SU-11248)；为观察IGFBP-6与舒尼替尼关系，786-O细胞株被小干扰IGFBP-6(siRNA-IGFBP-6，IGFBP-6抑制剂)预处理30 min。

1.2实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测 RT-PCR试剂盒(日本宝生物株式会社，批号：RR820A)，LipofectamineTM 3000转染试剂盒(美国 Invitrogen公司，批号：L3000001)，IGFBP-6在ccRCC及其临近癌旁组织(adjacent paracancerous tissue，ANCT)中mRNA的表达由ABI 7300 RT-PCR分析系统完成。先提取总RNA，再以20 μL体系反转录为cDNA。94 ℃预变性5 min，94 ℃ 45 s，60 ℃60 s，循环40次。每个样本设复孔3个，ABI 7300系统SDS软件分析mRNA比值。引物：IGFBP-6，5′-GAGGGGCTCAAACACTCTACG-3′(上游)和5′-CCATCCGATCCACACACCA-3′(下游)；β-actin，5′-GTAAACATCCGCAAAGAC-3′(上游)和5′-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3′(下游)。

1.3Western blotting检测 1.5 mL离心管收集6孔板细胞，每3个复孔计为一个样本，每孔细胞数计数约4×105个，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，加入4 ℃下新鲜配制的蛋白裂解剂 RMPI，冰上裂解 30 min，4 ℃下超声波水浴洗脱30 s，预冷离心机至4 ℃，18 000 g·min-1离心10 min(r=15 cm)，取上清液，弃去沉渣。二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)法测定获得的蛋白浓度，计算每个点样孔所需蛋白量，每孔取反应体系30 μg，4%～12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)胶分离蛋白，200 V、120 MA、25 W运行1 h， 分离后蛋白转印至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF) 膜，显影后观察转印效果，5%脱脂奶粉[三乙醇胺缓冲盐溶液 triethanolamine buffered saline solution(Tween)，TBST液配制]，室温反应1 h，分别加入1：1250阳性对照甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体与1：1250一抗 CD248单克隆抗体，置4 ℃冰箱孵育，摇晃，过夜，TBST 洗涤3次，每次5 min，加入1：2000二抗(兔抗)，室温孵育 1 h，TBST洗涤3次，喷涂电致化学发光分析法(electrochemiluminescence analysis，ECL)显影剂，反应3 min，置富士LAS-3000数码摄影系统，摄影存档。每组实验重复3次，取平均值。

1.4质粒转染 委托上海吉凯基因化学技术有限公司用化学合成方法制作两组不同序列的siRNA，siRNA1-IGFBP-6序列为5′--/GFP/CGGCTCCCGACGCGCCTTCG -3′，siRNA2-IGFBP-6序列为5′-/GFP/GTCCCGGTGACCTTCCTTGT-3′，阴性对照siRNA(siRNA-NC)序列为5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′，GFP为5′端绿色荧光基团。siRNA转染786-O细胞株，转染操作按照LipofectamineTM 3000说明书进行。作用于786-O细胞株48 h后，激光共聚焦显微镜(日本Nikon，Eclipse TE2000-E)观察细胞转染效率，收集细胞进行下一步研究。

1.5CCK-8法细胞增殖检测 取各组对数生长期786-O细胞，经0.25%胰酶消化后接种于96孔板，每孔细胞计数约5.0×103个。加RMPI1640无色培养基置37 ℃5%二氧化碳(CO2)细胞培养箱继续培养，按照CCK-8试剂盒说明书，分别于48，72 和 96 h后每孔添加RMPI1640无色培养基90 μL+CCK-8 10 μL，重新放回细胞培养箱，约3 h后酶联免疫检测仪(美国Thermo Spectra Ⅲ)在450 nm波长处测定吸光度(A值)，通过每孔细胞不同A值来反映该孔内活细胞数量。将阴性对照组A值设为100%，设为参照，计算各种细胞增殖率。细胞增殖率(%)=A值siRNA组/A值阴性对照组×100%。每组细胞设5 个复孔，实验重复3次。

2 结果

2.1IGFBP-6对人肾癌细胞系786-O的影响 与786-O细胞株比较，IGFBP-6基因在HK-2细胞株中的mRNA表达量下调67.5%，蛋白表达量下调61.8%(P<0.01)，见图1，图2。

①与HK-2比较，t=2.016，P<0.01。

1，2.786-O细胞株；3，4.HK-2细胞株

2.2siRNA-IGFBP-6质粒转染细胞786-O细胞系结果 化学合成siRNA5′端自带绿色荧光基团5′-GFP，48 h后，在Nikon激光共聚焦显微镜下可见脂质体破膜成功，成功转染进入细胞质及细胞核，转染效率>90%，siRNA主要位于细胞质，少量位于细胞核(图3， 左为空白，中为加荧光，右为上述两图重叠效果)。

图3 786-O细胞系转染siRNA 48 h后激光共聚焦显微镜影像(×10)

2.3IGFBP-6的作用 在786-O细胞系，舒尼替尼诱导并上调IGFBP-6 mRNA及蛋白表达，且呈剂量依赖性，Western blotting及RT-PCR结果均提示，舒尼替尼诱导786-O细胞株IGFBP-6蛋白表达呈剂量依赖性，50 μmol·L-1舒尼替尼作用于786-O细胞系24 h可达到最理想上调效果，故选用50 μmol·L-1作为舒尼替尼后续干扰实验剂量(图4)。为进一步探索IGFBP-6在舒尼替尼对 786-O细胞系中发挥的作用，采用siRNA抑制IGFBP-6。结果显示，两个siRNA干扰组siRNA1-IGFBP-6及siRNA2-IGFBP-6均能逆转舒尼替尼对 786-O细胞活力的影响，将阴性对照组(NC组) 设为参考值100%，可见siRNA1组及siRNA2组细胞生长率在72 h及96 h均较高于舒尼替尼组(P=0.000)(图5)。siRNA抑制IGFBP-6的表达能逆转舒尼替尼(50 μmol·L-1)对 786-O细胞活力的影响，将阴性对照组(NC组) 设为参考值100%，可见siRNA1组及siRNA2组细胞生长率在72 h及96 h均高于舒尼替尼组(P=0.000)。

图4 舒尼替尼对786-O细胞系中IGFBP-6水平的影响

图5 4组786-O细胞活力测定结果

3 讨论

1996年，COLLETT SOLBERG提出胰岛素样生长因子轴概念，随后研究不断深入，其成员也不断增加，由最初的IGFBP-Ⅰ、IGFBP-Ⅱ、IGFBP-R到后来IGFBP-6。实验表明，在体液和细胞内，IGFBP-6生物学作用尚未完全阐明，IGFBP-6除具有调节IGF功能外，还是一种重要的生长抑制因子，参与细胞衰老与凋亡等多种生理过程[8-11]。其主要介导细胞坏死，比胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)和胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)强约50倍[12]。其这一特点使其成为一个非常有力的IGF-Ⅱ活性抑制剂，其对IGF-Ⅱ依赖性的肿瘤生长产生抑制作用[13]，如神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤和结肠癌[10-13]等已有文献报道。这些研究结果提示IGFBP-6有明确的肿瘤生物学相关性，但在肾癌领域，笔者所见IGFBP-6与ccRCC的关系报道甚少。本课题组前期研究成果表明，IGFBP-6表达与ccRCC发生呈相关性[10]；与癌旁组织比较，ccRCC组织中IGFBP-6蛋白表达明显升高。通过对比原发肿瘤体积、淋巴结转移及周围脏器侵犯等指标，笔者发现IGFBP-6表达与ccRCC的TNM分期之间无明显相关性。本实验中，IGFBP-6在人ccRCC细胞系786-O中表达上调，使用siRNA-IGFBP-6抑制IGFBP-6表达可逆转50 μmol·L-1舒尼替尼对786-O细胞增殖的影响。因此，通过靶向下调IGFBP-6基因表达，抑制786-O细胞增殖，提高ccRCC患者存活率，是一条可行的途径。

苹果酸舒尼替尼是最近十年来开发的用于治疗转移性ccRCC的多靶向药物，是一种高度特异性多激酶抑制剂，其主要作用靶点有血小板衍生生长因子受体激酶(platelet derived growth factor receptor kinase，PDGFR)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等，其主要通过抑制肾癌细胞增殖来发挥抗肿瘤作用[4-5，14-18]。本研究结果显示，在786-O细胞系，舒尼替尼可上调IGFBP-6表达。IGFBP-6抑制剂siRNA-IGFBP-6能逆转舒尼替尼对786-O细胞系的影响。这些研究成果表明，IGFBP-6参与了舒尼替尼的抗肿瘤作用过程。但IGFBP-6抗肿瘤具体作用机制，即IGFBP-6具体是通过哪条信号通路来影响细胞的增殖、坏死、凋亡等，尚待进一步研究。

本研究结果表明，IGFBP-6 与ccRCC 发生、发展呈正相关，IGFBP-6 可能是舒尼替尼的一个药物作用靶点，参与舒尼替尼抗肿瘤过程，为进一步明确舒尼替尼的药理机制提供了新的实验依据。