高效液相色谱一测多评法同时测定木丹颗粒中9种成分*

田甜，陈镜楼，黄徐英，林智娟，宋慧晶

(1.武汉市第四医院/华中科技大学同济医学院附属普爱医院药学部，武汉 430034；2.江汉大学医学院，武汉 430056)

木丹颗粒由黄芪、醋制延胡索、苏木、三七、赤芍、丹参、红花、川芎、鸡血藤等9味中药配伍而成，主要用于四肢末梢及躯干部麻木、疼痛及感觉异常，或见肌肤甲错、面色晦暗、倦怠乏力、神疲懒言、自汗等糖尿病性周围神经病变属气虚络阻证的治疗[1]。现代临床研究表明，木丹颗粒治疗糖尿病周围神经病变临床效果显著[2-4]，可有效改善患者生活质量和血流动力学，降低血脂，提高神经传导速度，安全性较高[5]，对早期糖尿病肾病、血脂异常、糖尿病伴颈动脉硬化、糖尿病足、糖尿病自主神经病变等多种并发症均有明显疗效[6]，该药联合α-硫辛酸可明显降低血清同型半胱氨酸水平[7]，联合贝前列素钠、依帕司他可明显改善正中神经和腓总神经运动神经传导速度和感觉神经传导速度[8]，联合红景天乳膏可降低总症状评分及足部感觉震动阈值，提高神经传导速度，明显改善患者临床症状[9]。木丹颗粒现行质量标准为国家药品标准YBZ00422008，该标准仅对芍药苷和人参皂苷Rg1进行定量控制，未对方中君药及其他药味所含成分进行定量研究，笔者也仅检索到对木丹颗粒所含单一成分延胡索乙素进行定量研究的文献报道[10]。中药及其制剂所含成分复杂，高效液相色谱一测多评法(high performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single-marker，HPLC-QAMS)的多成分同时测定多指标质量评价模式，有效降低了检验成本，解决了部分对照品不稳定等不足，近年来已逐步应用于中成药复方制剂质量控制。笔者在本实验采用HPLC-QAMS法，以延胡索乙素为内参物，对木丹颗粒中巴西苏木素、(±)原苏木素B、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱、延胡索乙素、去氢紫堇碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素进行同时测定，以期为全面科学评价木丹颗粒质量提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 Waters 2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Agilent 1290型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；BSA224S型电子天平(德国Sartorius公司，感量：0.1 mg)；HU31208型超声波清洗器(上海珂淮仪器有限公司)；Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，WondaSil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2试药 延胡索乙素对照品(批号：110726-201819，CAS号：2934-97-6，含量：99.8%)、(±)原苏木素B对照品(批号：111882-201302，CAS号：102036-29-3，含量：98.9%)和毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(批号：111920-201606，CAS号：20633-67-4，含量：97.6%)购自中国食品药品检定研究院；巴西苏木素对照品(批号：PRF8032701，CAS号：474-07-7，含量：99.1%)、四氢非洲防己碱对照品(批号：PRF8050321，CAS号：483-34-1，含量：98.4%)、四氢黄连碱对照品(批号：PRF8070621，CAS号：4312-32-7，含量：99.8%)、毛蕊异黄酮对照品(批号：PRF8062601，CAS号：20575-57-9，含量：99.6%)和芒柄花素对照品(批号：PRF8091225，CAS号：485-72-3，含量：99.9%)购自成都普瑞法科技开发有限公司；去氢紫堇碱对照品(批号：CFS201901，CAS号：83218-34-2，含量：98.0%)购自武汉天植生物技术有限公司；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯；木丹颗粒(规格：每袋7 g，批号：10181124，10190102，10190415)来源于辽宁奥达制药有限公司。

2 方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1混合对照品储备液 分别精密称取巴西苏木素、(±)原苏木素B、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱、延胡索乙素、去氢紫堇碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素对照品各适量，置同一量瓶，用甲醇制成浓度分别为0.982，0.714，0.206，0.478，0.324，0.358，0.212，0.116和0.372 mg·mL-1的混合对照品储备液。

2.1.2混合对照品溶液 精密吸取“2.1.1”项混合对照品储备液2.5 mL，用甲醇制成巴西苏木素49.1 μg·mL-1、(±)原苏木素B35.7 μg·mL-1、四氢非洲防己碱10.3 μg·mL-1、四氢黄连碱23.9 μg·mL-1、延胡索乙素16.2 μg·mL-1、去氢紫堇碱17.9 μg·mL-1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷10.6 μg·mL-1、毛蕊异黄酮5.8 μg·mL-1和芒柄花素18.6 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.1.3供试品溶液 取木丹颗粒，研成细粉，精密称取约1.0 g，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声波清洗器超声处理30 min，放冷后称定质量，用甲醇补重，滤过 ，制成木丹颗粒供试品溶液。

2.1.4阴性样品溶液 按国家药品标准YBZ00422008中木丹颗粒的工艺处方分别制备缺苏木、缺醋制延胡索、缺黄芪的阴性样品，再按上述方法分别制成阴性样品溶液。

2.2色谱条件 Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温30 ℃；乙腈(A)-0.2%甲酸溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～11.0 min，10.0%A；>11.0～20.0 min，10.0%A→15.0%A；>20.0～41.0 min，15.0%A→42.0%A；>41.0～57.0 min，42.0%A→55.0%A；>57.0～65.0 min，55.0%A→10.0%A)，流速1.0 mL·min-1；检测波长分别为280 nm[0～41.0 min检测巴西苏木素、(±)原苏木素B、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱、延胡索乙素和去氢紫堇碱][11-14]和254 nm(41.0～65.0 min检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素)[15]；进样量10 μL。精密吸取“2.1.2～2.1.4”项下各溶液依法进样检测，巴西苏木素、(±)原苏木素B、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱、延胡索乙素、去氢紫堇碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素色谱峰峰形对称，分离度均>1.5，理论板数按各成分色谱峰计均≥4500，阴性样品对木丹颗粒中巴西苏木素、(±)原苏木素B、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱、延胡索乙素、去氢紫堇碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素定量测定无干扰，色谱图见图1。

A.混合对照品；B.木丹颗粒；C.苏木阴性样品；D.延胡索阴性样品；E.黄芪阴性样品；1.巴西苏木素；2.(±)原苏木素B；3.四氢非洲防己碱；4.四氢黄连碱；5.延胡索乙素；6.去氢紫堇碱；7.毛蕊异黄酮葡萄糖苷；8.毛蕊异黄酮；9.芒柄花素。

2.3线性关系考察 精密吸取“2.1.1”项混合对照品储备液0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 mL，用甲醇配制成6个浓度梯度混合对照品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定巴西苏木素、(±)原苏木素B、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱、延胡索乙素、去氢紫堇碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素峰面积，以峰面积(A)为纵坐标，质量浓度(C)为横坐标进行回归，结果见表1。结果表明巴西苏木素、(±)原苏木素B、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱、延胡索乙素、去氢紫堇碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素在各自范围内线性关系良好。

2.4精密度考察 精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液重复进样6次，测得巴西苏木素、(±)原苏木素B、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱、延胡索乙素、去氢紫堇碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素色谱峰峰面积RSD分别为0.58%，0.63%，1.17%，0.79%，1.01%，0.95%，1.13%，1.24%和0.86%。

2.5重复性考察 取同一批次木丹颗粒样品，按“2.1.3”项方法制备6份供试品溶液，依法进样测定巴西苏木素、(±)原苏木素B、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱、延胡索乙素、去氢紫堇碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素色谱峰峰面积，计算得9种成分含量RSD分别为0.91%，1.02%，1.73%，1.16%，1.39%，1.24%，1.65%，1.88%和1.30%。

2.6稳定性考察 精密吸取木丹颗粒同一份供试品溶液，于0，2，4，6，10，18 h进样检测巴西苏木素、(±)原苏木素B、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱、延胡索乙素、去氢紫堇碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素色谱峰峰面积，结果木丹颗粒供试品溶液18 h内稳定，9种成分的峰面积RSD分别为0.59%，0.65%，1.14%，0.81%，1.05%，1.37%，1.16%，1.26%和0.91%。

表1 9种成分线性关系与范围

2.7加样回收率实验 取9种成分含量已知的同一批次木丹颗粒样品，研成细粉，取9份，精密称取约0.5 g，随机分成3组，按照《中华人民共和国药典》2020年版四部要求加入混合对照品溶液[巴西苏木素0.654 mg·mL-1、(±)原苏木素B0.486 mg·mL-1、四氢非洲防己碱0.122 mg·mL-1、四氢黄连碱0.328 mg·mL-1、延胡索乙素0.186 mg·mL-1、去氢紫堇碱0.202 mg·mL-1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.146 mg·mL-1、毛蕊异黄酮0.068 mg·mL-1、芒柄花素0.262 mg·mL-1]0.5，1.0和1.5 mL各一组，使各组9种成分对照品加入量约为样品含有量的50%，100%和150%，再按照“2.1.3”项方法制成加样供试品溶液，依法进样测定巴西苏木素、(±)原苏木素B、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱、延胡索乙素、去氢紫堇碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素的峰面积，计算9种成分平均加样回收率及RSD值，结果见表2。

表2 9种成分加样回收率实验结果

2.8相对校正因子测定 采用多点校正法，精密吸取“2.3”项下6种混合对照品溶液依法进样测定巴西苏木素、(±)原苏木素B、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱、延胡索乙素、去氢紫堇碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素的峰面积，以延胡索乙素为内参物，按照计算公式：fk/m=fk/fm=(Ck×Am)/(Cs×Am)(式中C代表质量浓度，A代表峰面积，k代表内参物，m代表其他成分)计算巴西苏木素、(±)原苏木素B、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱、去氢紫堇碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素相对校正因子，结果见表3。

表3 各成分相对校正因子

2.9耐用性考察

2.9.1不同仪器、色谱柱 精密吸取“2.1.2”项混合对照品溶液，依法进样测定巴西苏木素、(±)原苏木素B、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱、延胡索乙素、去氢紫堇碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素峰面积，考察不同仪器(Waters 2695型、Agilent 1290型)、色谱柱(Agilent Zorbax SB-C18、Diamonsil C18、WondaSil C18)对相对校正因子影响，结果见表4。

表4 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响

2.9.2不同柱温 精密吸取“2.1.2”项混合对照品溶液，依法进样测定巴西苏木素、(±)原苏木素B、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱、延胡索乙素、去氢紫堇碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素峰面积，考察不同柱温(28，29，30，31，32 ℃)对相对校正因子的影响，结果见表5。

表5 不同柱温对相对校正因子的影响

2.10色谱峰的定位 精密吸取“2.1.2”项混合对照品溶液，依法进样测定，记录巴西苏木素、(±)原苏木素B、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱、延胡索乙素、去氢紫堇碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素色谱峰保留时间，以内参物延胡索乙素色谱峰为基准峰，采用相对保留时间值法(各待测成分与内参物保留时间的比值)对待测成分色谱峰进行定位，结果见表6。

表6 不同仪器、色谱柱各成分的相对保留时间值

2.11样品含有量测定 取3批木丹颗粒样品，按“2.1.3”项方法制成木丹颗粒供试品溶液(每批次平行制备3份)，依法检测巴西苏木素、(±)原苏木素B、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱、延胡索乙素、去氢紫堇碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素峰面积，首先采用外标法计算9种成分含量，再以延胡索乙素为内参物，根据“2.8”项建立的相对校正因子和计算公式计算巴西苏木素、(±)原苏木素B、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱、去氢紫堇碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素含量，结果见表7。结果表明HPLC-QAMS法计算值与外标法实测值差异无统计学意义，根据外标法检测平均含量的80%，暂定本品每袋含黄芪以毛蕊异黄酮葡萄糖苷计不得低于1.60 mg，以毛蕊异黄酮计不得低于0.70 mg，以芒柄花素计不得低于2.90 mg；含醋制延胡索以四氢非洲防己碱计不得低于1.30 mg，以四氢黄连碱计不得低于3.60 mg，以延胡索乙素计不得低于2.00 mg，以去氢紫堇碱计不得低于2.20 mg，含苏木以巴西苏木素计不得低于7.30 mg，以(±)原苏木素B计不得低于5.30 mg。

3 讨论

3.1检测指标成分的选择 木丹颗粒组方中，黄芪补脾胃之元气，气旺血行，祛瘀而不伤正，为方中君药，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素等黄酮类为其主要活性成分，对糖尿病周围神经病变临床疗效显著[16-17]。醋制延胡索活血散瘀、行气止痛，四氢非洲防己碱、四氢黄连碱、延胡索乙素和去氢紫堇碱等异喹啉类生物碱类为其主要药效成分，能够有效减弱急性炎症和神经性疼痛[18]；三七补血活血、散瘀止痛，合为臣药。苏木活血祛瘀、消肿止痛，巴西苏木素和(±)原苏木素B为其特征成分，通过影响糖尿病大鼠、人脐静脉内皮细胞自噬功能，治疗糖尿病性大血管病变[19]；丹参活血凉血、消痈镇痛，赤芍凉血镇痛，红花活血通经，川芎活血行气，共为佐药。鸡血藤补血活血、舒筋活络，为使药。诸药共奏，以达益气活血、祛瘀生新、通络镇痛功效[2]。本实验参考中药质量标志物[20-21]以君药为首选，同时兼顾臣佐使药的原则，选取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱、延胡索乙素、去氢紫堇碱、巴西苏木素和(±)原苏木素B为检测指标成分，可为全面评价木丹颗粒整体质量提供依据。

3.2流动相的选择 本实验在选择流动相时，首先对比了乙腈-水[15，22]、甲醇-水[23-24]洗脱效果，结果甲醇-水系统基线不平稳，干扰检测；乙腈-水系统基线平稳且分离效果较好，但毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮色谱峰因拖尾不能完全分离，故考虑在水相中加入弱酸(0.2%甲酸溶液[14，23-24]、0.2%醋酸溶液[11-12，25]、0.2%磷酸溶液[13])以改善峰形和分离效果，同时对优选后的流动相比例进行不断优化，最终确定以乙腈-0.2%甲酸溶液为流动相，按“2.2”项流动相比例对木丹颗粒中巴西苏木素、(±)原苏木素B、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱、延胡索乙素、去氢紫堇碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素进行同时检测。

笔者在本实验采用HPLC-QAMS法，对木丹颗粒中巴西苏木素、(±)原苏木素B、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱、延胡索乙素、去氢紫堇碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素9种成分含量进行同时测定，建立了木丹颗粒多指标成分质量控制方法，有助于药品生产企业不断完善制剂生产所有原药材种属、产地等源头控制，不断提升制剂质量控制标准以达到产品质量和临床疗效一致性，同时，HPLC-QAMS法利用中药有效成分间存在的内在函数关系，有效降低了检验分析成本，便于多组分质量控制模式的普及应用。笔者在本实验建立的方法操作便捷、结果准确，分析检测时间较短，降低了检验成本，对提升木丹颗粒质量标准具有一定指导意义。