基于GC-MS的川牛膝酒制前后化学成分变化分析△

童凯，李素峰，赖鑫，赵佳，钟伟萍，田孟良，张鑫，李东*

1.四川轻化工大学 生物工程学院/酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川 宜宾 644000；2.四川农业大学 农学院，四川 成都 611130；3.巴中市绿色农业创新研究院，四川 巴中 636000；4.四川省中医药发展服务中心，四川 成都 610011

川牛膝Cyathula officinalisKuan是我国常见川产道地中药材之一，也是原中华人民共和国卫生部批准可以用于保健食品生产的中药材原料之一，具有逐瘀通经、通利关节、利尿通淋的功效。截至2017年10 月，全国已注册的含“牛膝”类（川牛膝或怀牛膝Achyranthes bidentataBl.）的保健食品共44 个，涉及的功能主要包括增强免疫力、增加骨密度、缓解疲劳等，涉及的剂型有胶囊剂、酒剂、片剂、颗粒剂等，其中酒类剂型约占总数的18%，是继胶囊剂后的最常见剂型[1]。在中药药品生产或中药保健食品生产中，川牛膝通常需要经过酒制处理以达到增进功效的目的[2]。中医认为，药材经酒制处理后可增加或增强其上行、行散的功效，以及祛寒、去腥、助溶、减少不良反应等作用[3]。但是关于酒制处理对川牛膝化学成分谱的具体影响尚不明确，这限制了川牛膝酒制工艺的改进和产品质量控制水平的提升[4]。近年来，从化学成分角度的研究发现，酒制后川牛膝中除阿魏酸含量略有升高外[5]，其他已知的功效成分，如杯苋甾酮、大豆苷元、葛根素等含量均未出现显著提升[6]。这提示酒制处理对川牛膝成分谱的影响研究还需要进一步筛选鉴定新的质量控制指标成分。因此，本研究采用气相色谱-质谱法（GCMS）联合主成分分析（PCA）、偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）及系统聚类分析多变量统计分析方法，对川牛膝酒制前后的化学成分进行测定和分析，以期筛选出更多差异性成分，为含酒制川牛膝的中药药品或保健食品的深入开发和质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

7890型气相色谱-飞行时间质谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；Heraeus Fresco 17 型冷冻离心机（美国赛默飞科技有限公司）；JXFSTPRP-24 型研磨仪（上海净信科技有限公司）；D24 UV 型纯水仪（德国密理博有限公司）；PS-60AL 型超声仪（深圳市雷德邦电子有限公司）；DHG-9023A 型烘箱（上海一恒科学仪器有限公司）；LNG-T98 型真空干燥仪（太仓市华美生化仪器厂）。

1.2 试药

川牛膝药材采集自四川省雅安市宝兴县蜂桶寨乡，经四川农业大学田孟良教授鉴定为苋科植物川牛膝Cyathula officinalisKuan的根。

色谱纯甲醇（上海安谱实验科技股份有限公司）；色谱纯乙醇（天津市科密欧化学试剂有限公司）；色谱纯三氯甲烷、吡啶（上海阿达玛斯试剂有限公司）；甲氧胺盐酸盐[梯希爱（上海）化成工业发展有限公司]；三氟乙酰胺（BSTFA，含1%氯三甲基硅烷，美国Regis公司）；对照品核糖醇（货号：A5502-5G，纯度≥99%，美国Sigma公司）。

2 方法

2.1 药材处理

取川牛膝新鲜根，除去杂质和芦头，洗净、润透、切薄片，于65 ℃烘干即得生川牛膝。取生川牛膝50 g，按1∶5 加入无水乙醇，参照《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版（四部）附录（炮制通则）制成酒川牛膝[7]。合计制备生川牛膝和酒川牛膝各6批，分别编号C1～C6（生品）和P1～P6（酒制品），烘干后粉碎过20 目筛，保存备用。

2.2 分析样品的制备

分别精密称取生川牛膝和酒川牛膝样品50 mg，加入75%甲醇450 μL，加入核糖醇（内标物）10 μL，瓷珠研磨仪处理4 min（45 Hz），冰水浴条件下超声提取5 min（40 kHz，600 W），4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min（离心半径为10 cm），取上清液，置于真空浓缩器中干燥。然后在干燥后的提取物中加入甲氧胺盐试剂（20 mg·mL-1，甲氧胺盐酸盐溶于吡啶）80 μL，轻轻混匀后，放入烘箱中80 ℃孵育30 min。向每个样品中加入BSTFA 100 μL，将混合物于70 ℃孵育1.5 h；冷却至室温，即得供试品溶液。从各批次样品中等比例取适量样品混匀，即得质量控制样品（QC1～QC3）。

2.3 检测条件

色谱 柱：Agilent DB-5MS（30 m × 250 μm，0.25 μm）；载气：氦气；进样量：1 μL，不分流进样；隔垫吹扫流速：3 mL·min-1；柱流速：1 mL·min-1；柱箱升温程序：起始温度50 ℃，保持1 min，以10 ℃·min-1速度升高至310 ℃，保持8 min；前进样口温度：280 ℃；传输线温度：280 ℃；离子源温度：250 ℃；电离电压：-70 eV；质量范围：m/z50～500。

2.4 数据处理

使用Chroma TOF 4.3x 软件对质谱数据进行峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等分析。使用LECO-Fiehn Rtx 5 数据库，根据质谱匹配及保留时间指数匹配对检出物质进行初步定性。使用MetaboAnalyst 5.0 软件对数据进行预处理和PCA、PLS-DA和系统聚类分析等。

3 结果与分析

3.1 检测结果质量控制分析

3 个QC 样品按上述方法进样检测，计算内标物质（核糖醇）在3 个QC 样品中的峰面积RSD 为6.67%，计算3 个QC 样品所有峰面积的数据相关系数，平均为0.97，以上提示检测数据重现性较好，仪器运行和数据采集稳定，进一步说明整个方法稳定性较好，数据质量较高，可以用于后续统计分析。

3.2 酒制前后成分谱轮廓比较

经GC-MS 检测后，从总离子流图（图1）可以看出，川牛膝生品和酒制品的化学成分谱轮廓总体相似，难以从直观上判别两者的区别。图中未明显观察到有新成分的大量生成或原成分的大量消失，但部分离子峰强度可能发生了显著的变化，提示需要更加细致的数据分析。

图1 川牛膝样品GC-MS总离子流图

因此，对各色谱峰进行扫描后，从12 个供试样品和3 个QC 样品中共提取出646 个物质信号。采用无监督分析模式的PCA，对所有样品酒制前后的全部物质峰面积数据进行分析。结果发现，分析提取出的前2 个主成分PC1 和PC2 共表征了原始数据集39%的变异信息。在PC1 和PC2 构成的二维得分图上，来自于同一组别的样本具有相对集中的分布趋势，而C 组和P 组之间有较明显的分离分布趋势（图2），这说明酒制处理对川牛膝的总体成分轮廓具有明显的影响，而且这种影响并不仅针对少数指标成分，而是针对多成分的总体影响。因此，有必要采用更细致的分析方法进一步筛选造成炮制前后成分谱差异的主要贡献物质。除此之外，在主成分得分图上，3 个QC 样品的分布相对集中，这进一步说明所建立的检测方法稳定可靠。

图2 酒制前后川牛膝样品差异成分的PCA

3.3 酒制前后差异变化成分筛选

根据质谱匹配相似度及保留时间指数匹配对检出物质进行初步定性，一共初步鉴定60 个化学成分（表1），主要涉及有机酸、脂肪酸、糖类、氨基酸类等，根据酒制前后峰面积进行相对定量比较，有18 个成分显示升高，42 个成分显示下降，其中山梨醇、氧化脯氨酸、4-氨基丁酸、丙氨酸、丙三醇峰面积发生显著下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 川牛膝酒制前后GC-MC检出成分及其峰面积变化趋势

续表1

利用上述60 个已鉴定成分的峰面积数据，并将各供试川牛膝样本的分组信息纳入分析模型，建立有监督的PLS-DA 模型。交叉检验显示，模型拟合度（R2）=0.94，预测度（Q2）=0.54，说明建模效果良好。在此基础上，提取前2 个主成分绘制得分图显示（图3），C 组和P 组样本的空间分布仍然可以被明显地区分为2 个集群，说明这60 个已鉴定的成分中包含了可以反映川牛膝酒制前后主要差异的物质成分信息。在PLS-DA 模型中，第一主成分的变量重要性投影（VIP）值是筛选差异贡献成分的常用参数[8-9]，VIP 值＞1 则可视为对于样本分组具有显著作用（表1）。在本实验中，通过分析各成分的VIP值最终筛选得到20个差异贡献成分，其中包括6个氨基酸类成分、6 个糖类成分、4 个有机酸类成分、2个醇类成分、2个含氮化合物。采用这20个差异成分的峰面积数据对各样品进行系统聚类分析（图4），结果发现，C组和P组样品被分别聚为一组，这提示筛选出的20 个差异变化成分可以作为区别川牛膝生品与酒制品的潜在化学标记。

图3 酒制前后川牛膝样品差异成分的PLS-DA

图4 川牛膝酒制前后20个差异贡献成分相对含量变化

4 讨论

中药饮片是中成药和中药保健食品的直接原料。2019 年针对全国中药饮片质量的抽检结果表明，炮制不规范、加工不到位的问题较多，进而对中药产品的安全性和有效性形成潜在威胁，这与中药饮片质量标准研究滞后密切相关[10]。在《中国药典》2020 年版中，川牛膝无论酒制与否均以杯苋甾酮质量分数不低于0.03%作为含量测定项的质量控制指标，缺乏针对酒制饮片的专属质量控制指标。考虑到中药产品化学成分的复杂性，以及中药多成分、多靶点、多途径作用的特点，以揭示中药化学成分总体轮廓特征为目标的化学模式识别技术被广泛用于中药加工品的鉴别研究[11-12]。本研究建立的GC-MS从成分整体特征角度将生品与酒制品区分开来，可以为评价川牛膝酒制品提供参考。

酒制法作为一种常用的中药材加工方法，在中医临床上通常用以达到引药上行，增强祛风通络、矫味矫臭的作用，其原理一般可从药性、成分、药理等方面进行阐释[13]。相关研究表明，酒制可以显著影响药材中有机酸、糖苷、氨基酸、生物碱、黄酮、萜类等多种成分的转化和积累[14-16]，药材中的氨基化合物（蛋白质、多肽、氨基酸等）和羰基化合物（还原糖、不饱和脂肪酸、醛、酮等）在炮制时经缩合、聚合等复杂反应而生成类黑精物质的过程，即美拉德反应，可能在中药的品质形成和调控中发挥重要作用[17]。美拉德反应不仅能改变中药的色泽、香味，延长中药的货架期和保质期，还可能产生新的活性物质[18]。在本研究中，利用GC-MS 结合PLSDA等分析方法，分析川牛膝酒制前后化学成分的变化，一共筛选鉴定了20 个主要的差异变化成分，其中多数为美拉德反应底物（如糖类和氨基酸类），这提示美拉德反应可能是酒制川牛膝品质形成的重要因素。