广东怀集青心菊炭疽病病原菌的分子鉴定

崔一平，李一方，彭埃天，宋晓兵，凌金锋，黄 峰，陈 霞

（1.广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室，广东 广州 510640；2.怀集县农业农村局，广东 怀集 526400）

【研究意义】菊花Chrysanthemum〔Dendranthema morifolium（Ramat.）Tzvelev）〕属于菊科菊属，为多年生宿根草本植物，是我国十大名贵花卉之一和世界四大切花之一，其具有重要的文化意义和较高的经济价值。菊花除作为重要的观赏花卉外，有些种类还是重要的药用菊和茶用菊，如贡菊和杭菊等［1-4］。广东省怀集县青心菊为菊花的一种，主要用于切花观赏，不具有药用价值，目前在广东怀集已经形成了相关的产业，该产业的发展有效增加了当地农民的收入。【前人研究进展】在菊花生产过程中有很多的病虫害，如菊花黑斑病、青枯病、霜霉病、炭疽病、灰斑病、白粉病等，不仅种类繁多且由于菊花的生长特性使得这些病害具有多发性［5-8］。炭疽病是世界性的病害，广泛分布在全球各地，能够在多种蔬菜、作物、果树、花卉等植物上造成严重经济损失。引起炭疽病的病原菌为炭疽菌属真菌（Colletotrichumsp.），基于其科学和经济的重要性，该属真菌被列为全球第八大植物病原真菌。过去有报道在菊花的叶片上引起炭疽病症状的病原菌为胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides，但在花卉上还没有关于炭疽病菌引起病害的相关报道［6］。青心菊为菊花的一种，花型漂亮，很受大众的喜爱；同其他菊花一样，在青心菊上也存在着许多的病害，但目前很少有相关的报道。对于菊花病害的防治主要依赖化学农药，但是由于在菊花生产过程中相关标准的缺失，导致农药的误用和滥用现象普遍发生，从而严重影响了菊花在使用过程中的安全［7-10］。【本研究切入点】2019年5 月，我们在广东怀集占地约6.7 hm2的菊花种植基地进行病害调查时发现，有50%～80%的菊花植株叶片上出现圆形枯黄色病斑、花瓣则从顶端向下延伸出现水渍症状并变褐，严重影响菊花的生长状况和观赏价值。采集发病的菊花叶片和花朵进行病原分离和致病性测定，并对所得病原进行分子生物学鉴定；同时设置不同实验处理对菊花炭疽病在田间的防治药剂苯醚甲环唑可湿性粉剂、430 g/L 戊唑醇悬浮剂、咪鲜胺可湿性粉剂和30%噻呋·嘧菌酯悬浮剂，以及各药剂浓度进行筛选和分析。【拟解决的关键问题】明确引起菊花叶片和花瓣上炭疽病的主要病原菌，筛选防治效果较好的田间药剂，明确引起菊花炭疽病的病原菌及该病害在田间的最佳防治药剂，为菊花炭疽病的田间防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物：发病青心菊2019 年春季采集自广东怀集菊花种植基地，健康菊花植株也购买自该基地，后种植于温室中的灭菌土壤中，在自然光照下进行培养。

供试药剂：三唑类杀菌剂苯醚甲环唑可湿性粉剂（WP），广州丝誉药业有限公司和430 g/L戊唑醇悬浮剂（翠箭），中科；咪唑类杀菌剂咪鲜胺可湿性粉剂，广州佳途科技股份有限公司；复配剂30%噻呋·嘧菌酯悬浮剂（良尊），河北冠龙农化有限公司和40%噻呋·肟菌酯悬浮剂（润秀），宇龙化工。其中，苯醚甲环唑广泛应用于果树、蔬菜等真菌病害的防治；430 g/L 戊唑醇具有杀菌谱广和药效长的优点，主要用于小麦、蔬菜和果树等作物上的真菌病害；咪鲜胺主要作用于子囊菌和半知菌在大田作物、水果蔬菜、草皮及观赏植物上引起的病害；30%噻呋·嘧菌酯由24%噻呋酰胺和12%醚菌酯及其他助剂组成，对大部分高等真菌引起的病害均有防效；40%噻呋·肟菌酯由20%噻呋酰胺和20%肟菌酯组成，主要用于防治水稻、小麦等作物的纹枯病。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，去离子水定容至1 000 mL。

试剂及仪器：植物DNA 提取试剂盒，爱思进生物技术（杭州）有限公司；2×EasyTaqPCRSuperMix（-dye），北京全式金生物技术有限公司。带数字相机（Leica DFC450）的光学显微镜（Leica DM2500）及在使用过程中所用到的软件LAS v.4.5.0 software package（Leica）均购自广州市德灵实验仪器有限公司。微量离心机（Thermo Scientific Heraeus Pico 17/21 Fresco 17/21，Thermo Scientific，美国）、T100TM PCR 仪、核酸水平电泳槽（Mini-Sub Cell GT Cell1704406，伯乐，美国），上海凌仪生物科技有限公司。

1.2 试验方法

病原菌的分离与形态特征观察：选取感病菊花的叶片和花瓣，用解剖刀在病健交界处取出0.2 cm×0.2 cm 左右的小块，依次于70%酒精中30 s，2%NaClO 2～3 min，用无菌水冲洗3～5 次，置于无菌滤纸上在超净台中晾干，最后置于PDA 平板上25 ℃进行培养。3 d 后分离物上长出白色菌丝，挑取单孢子接种在新的PDA 平板上继续培养10 d 后，于显微镜下对分离所得代表菌株Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3 的菌丝和孢子进行镜检，至少观察60 个视野。

致病性测定：在液体PDA 培养基中分别对Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3 进行培养，制成 1×106孢子/mL 的孢子悬浮液，选取9 株带有花朵的健康青心菊植株和15 个花瓣进行喷洒接菌（每个菌株接种3 株青心菊和5 个花瓣）；而后放置于25℃培养箱中进行正常培养，湿度为85%，光照/黑暗为12 h/12 h；而后每天进行观察，并对发病症状进行拍照记录。

真菌分子生物学鉴定：以分离获得的代表菌株Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3 的全基因组DNA 为模板进行PCR 扩增。将培养7～10 d 纯化菌株的菌丝和孢子从PDA 平板上刮下来，迅速用液氮研磨。根据植物DNA 提取试剂盒的说明书提取DNA。选取核糖体转录间隔区（ITS）、大亚基基因large subunit（LSU）genesˎ几丁质合成酶Chitin synthase（CHS1）和肌动蛋白actin（ACT）的检测引物ITS1/ITS4、LR5F/LROR、CHS-79F/CHS-345R 和ACT-512F/ACT-783R 进行PCR 扩增［11-13］（表1）。反应体系：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性40 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32 个循环；72 ℃维持5 min。然后吸取5 μL PCR 产物进行电泳检测，并将获得的阳性PCR 产物送去测序；最后将获得的核酸序列在NCBI 的BLAST 中进行比对分析，同时基于获得的ACT 和CHS1 基因片段利用MegAlign 7.1.0（44）软件以最大自然法建立菊花炭疽病病原菌菌株Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3 的系统发育树，从而确定其分类地位；本试验用到的引物合成及PCR 产物测序服务均购自上海生工生物工程有限公司。

表1 供试引物及其参考文献Table 1 Primers for test and the references

2 结果与分析

2.1 青心菊炭疽病症状及病原菌的形态特征

经过2019 年的调查研究发现，青心菊炭疽病易发生在夏季高湿高温的环境中。该病发病初期，受侵染的植株叶片上初为黑褐色圆点，而后逐渐扩展为带有黄色晕圈的椭圆形褐色病斑，病斑中央变薄后脱落；花瓣顶端初为水渍症状，而后变为深褐色，最后花瓣萎蔫坏死。

对采集的病样进行常规组织分离，共获得8 株真菌菌株Cg1-1、Cg1-2、Cg1-3、Cg1-4、Cg1-5、Cg1-6、Cg1-7 和Cg1-8。经过培养发现，菌株的菌落在PDA 平板上均为圆形，最初为白色，而后变成灰白色，随着时间的推移，菌落上面散布出粉红色和黑色的圆点。8 个菌株的生长模式一致，本研究选取其代表菌株Cg1-1、Cg1-2和Cg1-3 进行后续研究。菌株Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3 的菌丝均为白色透明、有分枝和分隔，分生孢子单胞、椭圆形、透明且无隔膜，两端圆形，内含1 个油球，大小为14.5～18.9 μm×3.7～5.9 μm（n=50），初步鉴定菌株Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3属于炭疽菌属Colletotrichumsp.（图1 A～E）。图中的平板和孢子仅显示Cg1-1 的状态，Cg1-2 和Cg1-3 的菌落和孢子形态与Cg1-1 相似。

2.2 菌株Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3 的致病性测定

分别喷洒接种菌株Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3的孢子悬浮液于健康青心菊花瓣和叶片3 d 后，花瓣的尖端出现水渍状，叶片上出现小黑点；7 d后菊花植株的叶片和花朵上的接种症状与田间发病症状相似（图1F～H）。从接种发病的菊花叶片和花瓣上可再分离获得单一的与原接种菌株在培养性状和形态特征上相一致的病原菌。根据柯赫氏法则，菌株Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3 为青心菊炭疽病的致病菌。

图1 青心菊炭疽病的田间症状及其病原菌Cg1-1 的生物学特征和致病性测定Fig.1 Symptoms of anthracnose on Chrysanthemum in the field and the biological characteristics and pathogenicity test of pathogen Cg1-1

2.3 菌株Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3 的分子生物学鉴定

采用引物ITS1/ITS4、LR5F/LROR、ACT-512F/ACT-783R 和CHS-79F/CHS-345R 进行PCR扩增，分别得到558、877、260、299 bp 的片段。通过胶回收和测序后，把得到的序列在GenBank中进行BLAST 比对，发现菌株Cg1-1、Cg1-2和Cg1-3（ITS：MN 720559；LSU：MN 721338；ACT：MW 915856；CHS1：MW915855）与胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）（ITS：MN 714368；LSU：MH 875304；ACT:MN 919196；CHS1：MN075586）的同源性均达到了97.9%以上。基于获得的ITS、LSU、ACT和CHS-1 序列构建系统发育树发现，菌株Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3与炭疽菌属C.gloeosporioides的遗传距离最近，聚为一簇；而与隐秘刺盘孢菌C.aenigma的遗传距离最远。结合形态学特征及分子鉴定结果确定引起青心菊炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌C.gloeosporioides（图1）。文中仅显示基于CHS1 和ACT 序列构建的系统发育树，而分别基于ITS 和LSU 序列构建的系统发育树与其相类似（图2）。

图2 基于ACT 和CHS1 序列以最大自然法构建青心菊炭疽病菌株Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3 及其近缘属种的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of the pathogen strains Cg1-1，Cg1-2 and Cg1-3 of Chrysanthemum anthracnose and their relative strains based on ACT and CHS1 sequences with the maximum natural method

3 讨论

本研究确定了引起广东怀集青心菊炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌C.gloeosporioides，这是广东省首次报道胶孢炭疽菌在青心菊的花朵上引起炭疽病。前期有报道，胶孢炭疽菌能在韩国玫瑰上引起枝梢枯死，我国春羽和檀香紫檀上引起叶斑病以及在我国菊花叶片和茎秆上引起炭疽病［10，14-16］。有关引起菊花炭疽病病原菌C.gloeosporioides的侵染机制方面目前还没有相关的研究报道。

除此之外，本研究还对菊花炭疽病的田间防治效果进行调查。1号田和4号田种植的是青心菊，2 号田和3 号田种植的是其他品种的花卉。结果表明，菊花在5－7 月份炭疽病发生较严重，这跟当时的天气及降水状况有很大的关系。高温多雨有利于菊花炭疽病的发生。从田间的防治效果可以看出，2 000 倍液430 g/L 戊唑醇对菊花炭疽病的防治效果较差，而1 500 倍液苯醚甲环唑和1 500 倍液咪鲜胺对菊花炭疽病的防治效果较好，可以达到90%以上（未发表）。同时2 000 倍液噻呋·肟菌酯和噻呋·嘧菌酯对菊花炭疽病的防治效果一般。研究表明，苯醚甲环唑一直被广泛应用在核桃、柑橘、辣椒、槟榔等作物上炭疽病的防治且防治效果较好［17-20］，咪鲜胺则对芒果炭疽病及葡萄座腔菌引起的病害等有较好的防治效果［21-22］。而430 g/L 戊唑醇则主要用于防治小麦锈病、白粉病、赤霉病等［23-26］。噻呋·肟菌酯和噻呋·嘧菌酯能够有效预防和治疗水稻纹枯病等病害的发生［6，27］。以上5 种药剂均很少被报道应用在菊花病害的防治上。

近年来，通过对菊花炭疽病田间防治药剂的调查发现，由于菊花炭疽病防控相关研究的缺乏，导致花农在对该病害进行防治时缺乏正确的指导，存在大量农药误用和滥用的情况。本研究通过调查发现，对田间菊花炭疽病的防治，1 500 倍液苯醚甲环唑和1 500 倍液咪鲜胺均具有很好的防效；同时鉴于炭疽病的发生发展规律，在雨后进行有效的田间施药能够较大程度防治和减轻菊花炭疽病的发生和为害。

4 结论

引起广东怀集青心菊炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌C.gloeosporioides。在田间，1 500 倍液苯醚甲环唑可湿性粉剂和1 500 倍液咪鲜胺可湿性粉剂对青心菊炭疽病的防治效果最好，防治效果均在90%以上，推荐这2 种药剂作为田间防治菊花炭疽病的施用药剂。但是化学药剂防治仅为防治菊花炭疽病的一个手段，还应在种植过程中增强农业措施管理。目前急需在花卉病害防控方面相关政策的出台和实施。