4种清热解毒复方中草药体外抑菌及抗PRRSV活性研究
2022-03-03程耀蝶陈希文
孙 璐,张 静,尹 苗,2,程耀蝶,代 锟,吴 倩,2,赵 洪,2,陈希文,2
(1.绵阳师范学院,动物疫病防控与健康养殖工程技术研究中心,绵阳 621000;2.四川生猪重大疫病监测与防控工程研究中心,绵阳 621000)
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以发热、厌食、妊娠母猪出现流产、死胎等为主要症状的疫病。随着养殖业的快速发展,该病的患病几率也日益增长,PRRS症状复杂,难以控制[1],一旦感染了PRRSV,扁桃体、上呼吸道及肺脏的巨噬细胞、单核细胞等会被破坏,造成肺损伤和机体免疫抑制,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等病菌入侵机体导致猪死亡的风险就会大大增加,给养殖业造成严重危害。目前用于防制PRRSV的主要措施是接种疫苗,主要有灭活苗和弱毒苗两种[2],但两种疫苗的临床效果均不理想。因此,筛选有效的抗PRRSV和抑菌的药物是控制PRRSV的重要途径。
中草药属于纯天然产物,可以在不伤害机体的前提下直接杀死细菌和抑制病毒,不易产生耐药性,对机体毒副作用小[3]。大肠杆菌病、金黄色葡萄球菌病和PRRS均属于外感温热病范畴,因动物所患疾病通常是由细菌和病毒混合感染引起,所以中药的联合使用及使用复方成为了必然[4]。泻心汤、黄连解毒汤、三黄虎杖汤及清瘟败毒散在方剂中属于清热解毒类,现代的药理学研究初步证明了清热解毒复方中草药具有多种作用,可以抗病毒、调节免疫功能及抗菌等[5-6]。本试验探究了4种清热解毒复方中草药抗PRRSV和体外抑菌活性,以期为临床应用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 中草药
黄芩(山西,批号:201004)、黄柏(四川,批号:20081405)、栀子(四川,批号:200708)、青黛(福建,批号:190102813)、荆芥(四川,批号:200701)、防风(内蒙古,批号:200222)、羌活(四川,批号:201201)、大黄(四川,批号:202008104)、黄连(四川,批号:202011076)、虎杖(湖北,批号:B806251-01)均购自绵阳高新区凯立大药房。4种清热解毒复方组分及比例见表1。
表1 4种清热解毒复方组成
1.2 主要试剂及仪器
LB培养基、平板计数琼脂(PCA)、0.25%胰蛋白酶、低血清培养基等均购自绵阳市汇亿鑫科技有限公司;One Step PrimeScript Ⅲ RT-qPCR Mix、RNase-free ddH2O均购自宝生物工程(大连)有限公司。
CO2培养箱购自赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司;核酸提取仪购自济凡生物科技(常州)有限公司;倒置显微镜(Nikon)、旋转蒸发仪均购自上海亚荣生化仪器厂;荧光定量PCR分析仪购自杭州博日科技股份有限公司;振荡培养箱购自上海知楚仪器有限公司。
1.3 供试细菌和病毒
标准菌株大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、PRRSV均由绵阳师范学院动物疫病防控与健康养殖工程技术研究中心保存。
1.4 中草药提取
称取干燥后的单味中草药各50 g,加入500 mL蒸馏水,浸泡30 min后煎煮,沸腾后保持微沸状态煎煮1 h[7],8层医用纱布过滤;滤渣中加入300 mL蒸馏水,煎煮至沸腾后再保持微沸30 min,合并2次水煎提取的滤液;将滤液蒸发浓缩直至成为浸膏,再将浸膏烘干、粉碎。按4种复方的配比配制成初始浓度为250 mg/mL的药液,高压蒸汽灭菌锅121 ℃灭菌15 min[8],4 ℃保存备用。
1.5 体外抑菌试验
1.5.1 菌悬液制备 将保存的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌活化后,接种于LB肉汤培养基,37 ℃培养18~24 h[9]。用生理盐水稀释细菌浓度直至108CFU/mL,作为试验所需浓度。
1.5.2 体外抑菌活性的测定 每15支EP管为一组。在2~14号管中各加入500 μL无菌LB肉汤,1号管中加入1 000 μL 250 mg/mL的药液,取出500 μL加入2号管,吹打混匀,重复操作,直至12号,依次获得62.50、31.25、15.63、7.81、3.90、1.95、0.98、0.49、0.24、0.12 mg/mL的药液,在1~12号管中每管加入50 μL 108CFU/mL的菌悬液;13号管作为空白对照,14号管中加入50 μL菌悬液作为阳性对照,15号管中加入500 μL药液和50 μL生理盐水作为阴性对照,涡旋混匀,37 ℃振荡培养24 h后观察混浊程度。将药液和细菌的混合液每个浓度取2 μL点样于LB平板上,每一组点样3个平板作为对照,肉眼观察LB平板是否有细菌生长,将无菌生长的最小浓度作为该中草药的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)[10]。
选出无菌生长的浓度,吸取菌药液100 μL涂布于平板计数琼脂上,设置3个平行对照,37 ℃恒温培养18~24 h后对平板进行计数[11],3个平行对照取平均值,以菌落总数<5的最低浓度作为该中草药的最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)[12]。
1.6 体外抗PRRSV试验
1.6.1 复方中草药对Marc-145细胞最大安全浓度的测定 用细胞维持液将复方中草药从初始浓度250 mg/mL二倍倍比稀释到2-10,依次加到长成单层Marc-145细胞的96孔细胞培养板上,每孔100 μL,各稀释度均重复4孔,设置细胞对照[13]。在37 ℃、5% CO2培养箱中培养72 h,将96孔细胞板放在倒置显微镜下观察细胞病变情况[14],以4孔均不出现病变为最大安全浓度[15]。
1.6.2 病毒半数组织培养感染剂量的测定 将待测病毒进行10倍稀释,直至10-6,加到长满单层Marc-145细胞的96孔细胞培养板上,每孔100 μL,每个稀释度重复8孔,在37 ℃、5% CO2培养箱中培养5 d,通过Reed-Muench法计算病毒液的半数组织培养感染剂量(median tissue culture infective dose,TCID50)[16]。
距离比例=(高于50%的病变率-50%)/(高于50%病变的病变率-低于50%的病变率)
TCID50=高于50%病变的病毒最高稀释度的对数+距离比例
1.6.3 中草药对病毒吸附细胞的阻断作用 以复方最大安全浓度为初始浓度,用细胞维持液二倍倍比稀释复方后,加在长满单层细胞的细胞培养板中,每孔100 μL,每个稀释浓度重复4孔,37 ℃培养4 h后弃去原液;每孔中再加入100 μL 100 TCID50的病毒液,培养2 h[17],弃去液体;每孔加入100 μL维持液,培养72 h,设置病毒对照。
1.6.4 中草药对病毒合成复制的抑制作用 在长成单层Marc-145细胞的96孔细胞培养板中加入100 μL 100 TCID50病毒液,37 ℃吸附2 h;加入不同稀释度的中草药稀释液,每孔100 μL,重复4孔,37 ℃培养4 h后[17],弃去原液;加入100 μL维持液,培养72 h,设置病毒对照。
1.6.5 中草药对病毒的直接杀灭作用 将不同稀释度的中草药与等体积的100 TCID50病毒液混合,加到96孔细胞培养板上,37 ℃作用4 h,弃去混合液;加100 μL维持液,培养72 h[18],重复4孔,设置病毒对照。
1.6.6 实时荧光定量RT-PCR检测 通过自动核酸提取仪提取病毒RNA,参考路斌等[19]设计引物和探针,上游引物:5′-GCTAGGCCGCAAGT-ACATWC-3′;下游引物:5′-ATCATTTGCCGC-AATCG-3′;探针:5′-CCCCTGCCCACCACGTY-GECLIPSE-3′。引物及探针均由北京华大基因研究中心合成。
PCR反应体系15 μL:One Step PrimeScript Ⅲ RT-qPCR Mix 7.5 μL,上、下游引物及探针各0.5 μL,RNase-free ddH2O 4 μL,RNA模板2 μL。PCR扩增程序:52 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40个循环。检测结果成立的标准是阳性对照FAM荧光Ct值<38,阴性对照无信号。若中草药复方对病毒无抑制作用,则样品中会含有病毒核酸,导致出现Ct值和特异的扩增曲线;若中草药复方对病毒有抑制作用,则样品中无病毒核酸,不会出现Ct值和特异扩增曲线,从而得出中草药抗病毒效果。
2 结 果
2.1 4种复方中草药的体外抑菌活性
由表2可知,4种复方中草药的体外抑菌活性差异较大,其中泻心汤对大肠杆菌的抑菌活性最强,MIC和MBC均为7.81 mg/mL;其次是黄连解毒汤和三黄虎杖汤,黄连解毒汤MIC为31.25 mg/mL,MBC为62.50 mg/mL,三黄虎杖汤MIC为62.5 mg/mL,MBC为125 mg/mL;清瘟败毒散对大肠杆菌没有明显的抑制效果。 泻心汤、黄连解毒汤和三黄虎杖汤对金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性较好,泻心汤和三黄虎杖汤的MIC均为0.24 mg/mL,MBC均为0.49 mg/mL;黄连解毒汤的MIC为0.49 mg/mL,MBC为0.98 mg/mL;清瘟败毒散的体外抑菌活性较差,MIC和MBC均为125 mg/mL。
表2 4种复方中草药对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性
2.2 4种复方中草药在Marc-145细胞上的最大安全浓度
观察细胞病变情况,结果表明,黄连解毒汤对细胞的毒害性最小,最大安全浓度为3.90 mg/mL,其次为清瘟败毒散(表3)。
表3 4种复方中草药在细胞上的最大安全浓度
2.3 PRRSV的TCID50
经过5 d的培养,稀释度在10-3至10-4时,50%的细胞孔出现了病变;当稀释度为10-1和10-2时,全部的细胞孔均出现病变;当稀释度为10-3时,8个细胞孔中有5个细胞孔发生了细胞病变,当稀释度10-4时,8个细胞孔中只有3个细胞孔发生病变,利用Reed-Muench法计算出PRRSV的TCID50为10-3.6(表4)。
表4 PRRSV的TCID50
2.4 4种复方中草药的抗病毒试验
实时荧光定量PCR结果显示,阳性对照的Ct值为32.18,3种作用下不同复方中草药抗病毒结果见表5。由表5可知,阻断作用中,泻心汤在1/4和1/8最大安全浓度都出现了病毒Ct值,分别为36.80和35.02,而在最大安全浓度和1/2最大安全浓度下无Ct值,说明在1/2最大安全浓度(0.24 mg/mL)下,泻心汤对PRRSV有阻断作用,三黄虎杖汤在0.12 mg/mL有阻断效果,黄连解毒汤和清瘟败毒散均在0.98 mg/mL对PRRSV有较好的阻断作用;4种复方中草药对病毒的抑制作用和直接杀灭作用都未出现Ct值,说明4种复方中草药对PRRSV的抑制作用和直接杀灭作用较好。
表5 4种复方中草药抗病毒作用
3 讨 论
大肠杆菌病、金黄色葡萄球菌病和PRRS是养殖中常见的疾病,都属于外感温热病范畴,治疗则以清热解毒中草药为主。泻心汤具有泻火解毒、燥湿泄热的作用[20-21];黄连解毒汤主治火热实证[22],主要用于清热解毒[23];三黄虎杖汤主要具有清热解毒、活血化瘀的功能,清瘟败毒散能清热解毒、泻火通便[24],所以本试验选取了这4种组方较为简单的复方中草药进行体外的抑菌抗病毒研究。
在抑菌方面,中药的一些成分能直接破坏细菌最外面的细胞膜和细胞壁,导致细菌自身的代谢出现紊乱,达到在体外抑制致病菌的效果[25]。王钰雄等[26]研究中泻心汤对普通耐药金黄色葡萄球菌的MIC为0.3125 mg/mL,与本试验中泻心汤对金黄色葡萄球菌的结果相近,可能是因为大黄、黄连、黄芩3种中草药都有一定的抑菌效果[27],大黄中含有的大黄酸、黄芩中含有的黄芩素均能够使细胞通透性增大,造成细菌细胞内容物流出,最终导致致病菌死亡[28]。本试验中黄连解毒汤对大肠杆菌抑菌活性MIC和MBC分别为31.25和62.5 mg/mL,与吕颜枝等[29]研究黄连解毒汤对鸡大肠杆菌的MIC为250 mg/mL结果相近。耿梅英等[30]研究发现,清瘟败毒散提取液对金黄色葡萄球菌ATCC 25923的MIC为8 mg/mL,抑菌效果较好,其所用的清瘟败毒散主要药物为黄连、金银花、连翘、甘草、丹皮,而本研究中的清瘟败毒散组方与之不同,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制效果较差。可能是因为本试验采用的是最为传统的水煎法,但是有些中药成分是不溶于水的,热稳定性也不好,所以提取出的有效成分有限,而这些有效成分之间产生了颉颃作用,导致其抑菌效果较差。
在抗病毒方面,4种复方中草药主要成分为黄连和黄芩,黄连主要成分为生物碱,具有清热解毒、抗菌、抗病毒等作用;黄芩有效成分为黄芩苷、黄芩素等黄酮类物质,具有除热、抗炎及抗菌等功效[31]。4种复方中草药对病毒均有阻断作用,可能是因为其中的多糖、三萜类等生物活性成分干扰病毒蛋白和RNA的合成或与病毒直接结合,抑制病毒复制或破坏其结构有关。研究发现,大黄、黄柏等单味中药可以直接抗病毒[32];黄芩具有抗PRRSV的作用[33];黄连的提取液可以抑制RNA聚合酶发挥抗病毒的作用[34],均与本研究结果相近。4种复方中草药的抑制作用和直接杀灭均较好,可能是因为单味中药之间产生协同效应,复方可以通过抑制病毒的黏附、合成等机制发挥抗病毒作用[35]。但是4种复方中草药的组分均非单一活性成分,起关键作用的是哪一成分或是多靶点协同的抗病毒作用有待进一步研究[36]。冼琼珍等[37]研究发现,黄芩、黄连及黄柏对PRRSV有较好的阻断作用,其中黄芩和黄连的抑制作用比阻断作用好,但是黄柏和黄连几乎对PRRSV没有直接灭活的作用。唐耀平等[38]研究发现,清瘟败毒散对高致病性PRRSV的预防和治疗的有效率达75%。本试验结果表明,4种复方中草药在体外的抗病毒效果均较好,但中药中能够抗病毒的成分很少[39],所以还需要进行更深入的研究。
本研究采用传统方法提取4种清热解毒复方中草药活性成分,以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和PRRSV作为病原体在体外进行了抑菌抗病毒试验并取得了良好效果,但由于中草药成分复杂,相关作用机制研究有限,且进入机体内后还会受到温度、pH、作用部位及宿主健康状况等多种因素影响,因此若要实现中药普及应用于兽医临床还需要进一步深入的研究。
4 结 论
本研究结果表明,4种清热解毒复方中草药中泻心汤体外抑菌及抗PRRSV的效果最好,其次是三黄虎杖汤、黄连解毒汤和清瘟败毒散,4种清热解毒复方均有一定的体外抑菌和抗病毒活性,该研究结果可为猪场临床用药提供一定参考。