银条菜粗多糖脱蛋白的方法研究

李 洁，陈 琳，刘海棠, ，刘 锐，朱铭强

(1. 中国轻工业造纸与生物质精炼重点实验室，天津市制浆造纸重点实验室，天津科技大学轻工科学与工程学院，天津 300457；2. 食品营养与安全国家重点实验室，天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457；3. 西北农林科技大学机械与电子工程学院，杨凌 712100)

银条菜属唇形科水苏属多年生草本植物，主要分布于中国河南省偃师市．银条菜中富含蛋白、碳水化合物和脂肪，经常食用对人体有多种保健效果，延年益寿作用明显，并且具有增强免疫能力、软化血管、降血脂、改善血液循环等功能[1]．银条多糖具有多种生物活性，如免疫调节[2]、肠道益生[3]、降血糖[4]、抑菌[5]、解酒护肝、抗肿瘤等[6]．以银条菜作为原料提取的水苏糖，具有重要的药用及医用价值，这也为银条菜的综合利用开辟了新途径[7]．

通常情况下，水提或者醇提获得的多糖往往含有蛋白[8]，而蛋白的存在可能会影响多糖的生物活性.因此，如何有效去除蛋白且同时避免多糖生物活性降低，成为一个非常有意义的研究课题．不同来源的多糖有各自适宜的脱蛋白方法．初雅洁[9]通过对辣木多糖除蛋白的研究，发现酶法除蛋白对辣木多糖的蛋白脱除率和多糖保留率最好．王新嘉等[10]研究发现三氯乙酸法(TCA法)除蛋白对平菇多糖中蛋白的脱除率最高，多糖保留率最好．而对银条菜多糖目前尚未见其脱蛋白的相关研究报道．

本文采用TCA法、盐析法以及盐酸法对银条菜粗多糖进行脱蛋白方法研究，为后续银条菜多糖的分离纯化以及生物活性的探究提供依据．

1 材料与方法

1.1 原料与仪器

银条菜购于河南省偃师市农贸市场．三氯乙酸，天津市大茂化学试剂厂；硫酸，国药集团化学试剂有限公司；牛血清蛋白、苯酚，北京索莱宝科技有限公司；氢氧化钠，天津市津东天正精细化学试剂厂；考马斯亮蓝G250、无水氯化钙，福晨(天津)化学试剂有限公司；葡萄糖，阿拉丁(上海)试剂有限公司；无水乙醇，天津市江天化工技术股份有限公司；盐酸，天津市风船化学试剂科技有限公司；半乳糖醛酸，上海瑞永生物科技有限公司；蒽酮，北京博奥拓达科技有限公司．本实验所用试剂纯度均为分析纯．

TU-1810型紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；XMTD-4000型电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司；BAO-150A型精密鼓风干燥箱，施都凯仪器设备(上海)有限公司；DFT-50A型50克手提式高速粉碎机，温岭市林大机械有限公司．

1.2 实验方法

1.2.1 粗多糖的提取[11]

银条菜清洗干净后，于60℃恒温干燥箱中烘至质量恒定，粉碎机中磨碎，过80目筛，装入聚乙烯瓶中，放入干燥器中备用．取处理好的样品与蒸馏水按质量比1∶30混合，放入超声清洗机中超声处理30min，抽滤；收集滤液，旋转蒸发浓缩至原体积的五分之一，加入4倍体积无水乙醇，4℃放置24h，离心收集沉淀；将沉淀依次用无水乙醇、乙醚洗涤，再于60℃烘箱中烘至质量恒定，得到银条菜粗多糖．

1.2.2 多糖含量的测定

通过苯酚-硫酸法[12]测定银条菜粗多糖中的多糖含量．用电子天平称量烘至质量恒定的葡萄糖标准样品100.00mg，用蒸馏水定容至100.00mL，配制成1.00mg/mL的标准储备液备用．取1mL储备液定容至10mL，得到100µg/mL的葡萄糖标准溶液．分别取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL标准液置于10mL具塞试管中，再分别加蒸馏水将体积补至1.00mL．向各试管中加入1.00mL的6.00%苯酚溶液(体积分数)，再加入5.00mL浓硫酸，混合均匀．于沸水浴中加热30min，取出后冷却，用紫外分光光度计在490nm处以蒸馏水为参比测定吸光度，测3组平行样，取平均值．以葡萄糖质量浓度(µg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线．所得曲线为y＝0.0072x－0.0066，R2＝0.9997．

取粗多糖用蒸馏水配制成10.00mg/mL的溶液，再用蒸馏水稀释100倍，量取1.00mL稀释液于试管中，测定吸光度，将吸光度代入标准曲线中计算葡萄糖质量浓度(µg/mL)．按照式(1)计算多糖保留率．

式中：ρ0为样品脱除蛋白前所配制溶液中多糖的质量浓度；ρ1为样品脱除蛋白后所配制溶液中多糖的质量浓度．

1.2.3 蛋白含量的测定

采用考马斯亮蓝G250法对银条菜粗多糖中的蛋白进行测定．取10.00mg牛血清蛋白用蒸馏水定容至100mL得到100µg/mL蛋白标准溶液．称量25mg的考马斯亮蓝G250试剂溶解于12.50mL体积分数为95%的乙醇溶液，加入25.00mL 质量分数为85%的磷酸，用蒸馏水定容至250mL，得到考马斯亮蓝G250工作液．分别取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL蛋白标准溶液于试管内，用蒸馏水将体积补至1mL，分别加入5.00mL考马斯亮蓝G250工作液，混合均匀，放置反应2min，用紫外分光光度计在595nm波长下测定吸光度，测3组平行样，取平均值．以蛋白溶液质量浓度(µg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线．所得曲线为y＝0.0063x－0.0113，R2＝0.9977．

称量粗多糖样品，用蒸馏水配制成10.00mg/mL的溶液，量取1.00mL，按照上文所述方法进行操作，对样品中的蛋白质量浓度(µg/mL)进行测定．按照式(2)计算蛋白去除率．

式中：ρ2为样品脱除蛋白前所配制溶液中蛋白的质量浓度；ρ3为样品脱除蛋白后所配制溶液中蛋白的质量浓度．

1.2.4 糖醛酸含量的测定

采用咔唑硫酸改良法[13]测定糖醛酸的含量．精确称量10.00mg半乳糖醛酸，用蒸馏水定容至100mL，得到质量浓度为100µg/mL的标准溶液，备用．配制四硼酸钠-硫酸溶液，称取0.956g四硼酸钠溶于200mL浓硫酸中．分别取标准溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mL置于具塞试管中，加蒸馏水将体积补至0.50mL；将试管放入冰水浴中，分别加入3.0mL四硼酸钠-硫酸溶液，混匀后于85℃的水浴中加热20min，取出冷却后，加入0.10mL 0.10%的咔唑-无水乙醇溶液(质量分数)，混合均匀后，室温下反应2h．用紫外分光光度计在530nm处测吸光度，测3组平行样，取平均值．以半乳糖醛酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线．所得曲线为y＝0.006x－0.0158，R2＝0.9913．

称取粗多糖样品配制成10.00mg/mL溶液，稀释5倍，取0.50mL于试管中，按上文所述方法，对样品中糖醛酸质量浓度(µg/mL)进行测定．按照式(3)计算糖醛酸保留率．

式中：ρ4为样品脱除蛋白前所配制溶液中糖醛酸的质量浓度；ρ5为样品脱除蛋白后所配制溶液中糖醛酸的质量浓度．

1.3 脱蛋白方法

1.3.1 TCA法[14-15]

取1.2.1节中提取到的粗多糖配制成10.00mg/mL的溶液50mL，在溶液中分别加入相等体积的体积分数分别为2.00%、5.00%、10.00%、15.00%、20.00%的三氯乙酸溶液，混合均匀后于4℃放置12h，抽滤去除沉淀，得到脱蛋白溶液．

1.3.2 盐析法[16]

取1.2.1节中提取到的粗多糖配制成10.00mg/mL溶液50mL，用NaOH溶液调节粗多糖溶液pH为8.0，水浴加热至85℃，分别加入0.10、0.30、0.50、0.70、0.90g无水CaCl2，混匀后沸水浴30min；取出后冷却至室温，抽滤去除沉淀，得到脱蛋白溶液．

1.3.3 盐酸法[17]

取1.2.1节中提取到的粗多糖配制成10mg/mL溶液50mL，用2mol/L盐酸溶液分别调节粗多糖溶液pH为1、2、3、4、5，4℃保存12h，抽滤除去沉淀，得到脱蛋白溶液．

1.4 紫外光谱分析

将未脱蛋白溶液和已脱蛋白溶液均稀释10倍，用紫外分光光度计于200～400nm进行光谱扫描．

2 结果与讨论

2.1 TCA法

TCA溶液的体积分数对溶液中蛋白去除率、多糖保留率、糖醛酸保留率的影响如图1所示．

图1 TCA溶液的体积分数对蛋白去除率、多糖保留率、糖醛酸保留率的影响Fig. 1 Effectof the volume fraction of TCA solution on protein removal rate，polysaccharide retention rate and uronic acid retention rate

由图1可知：蛋白去除率随着TCA溶液体积分数的增大而降低．在TCA溶液的体积分数为5.00%时，蛋白去除率达到97.25%，随着添加TCA体积分数的增大，去除率略微下降．多糖保留率随TCA体积分数的增大而明显降低，在TCA溶液体积分数为5.00%时达到86.89%．这可能是由于多糖中蛋白的等电点对应pH与溶液的pH 接近，而且TCA 作为变性剂使蛋白的构象发生变化，暴露出更多的疏水基团而聚集沉淀，而蛋白沉淀的同时，吸附了一定量的多糖造成损失[18]．高浓度的TCA可以在一定的程度上造成银条菜多糖水解，进而引起多糖结构发生变化[19-20]．糖醛酸保留率呈先增后减的趋势，在TCA溶液的体积分数为5.00%时达到最大98.67%，这可能是由于糖醛酸在酸性条件下发生水解．虽然TCA体积分数2.00%时多糖保留率是最大的，但是2.00%和5.00%时两者的多糖保留率相差不到1.00%，而糖醛酸保留率差距较大；故综合考虑糖醛酸保留率、多糖保留率以及蛋白去除率等指标，TCA溶液的体积分数为5.00%时综合效果最好，所以，TCA法除蛋白时，确定TCA溶液的最佳体积分数为5.00%．

2.2 盐析法

无水CaCl2添加量对蛋白去除率、多糖保留率、糖醛酸保留率的影响如图2所示．

图2 无水CaCl2添加量对蛋白去除率、多糖保留率、糖醛酸保留率的影响Fig. 2 Effect of addition to anhydrous CaCl2 on protein removal rate，polysaccharide retention rate and uronic acid retention rate

由图2可知：样品中蛋白去除率随着无水氯化钙添加量的增大而呈现先增后减的趋势，无水CaCl2添加量为0.30g时达到最大值90.61%，此后随着无水氯化钙添加量的增加而逐渐降低．溶液中多糖和糖醛酸的含量随着无水CaCl2的添加呈现先升高后降低的趋势，在无水CaCl2添加量为0.30g时保留率最大，分别为83.59%、88.67%．这可能是由于随着中性盐浓度的增加，蛋白表面的水化膜和电性被破坏而发生沉降[21]，但其沉降的蛋白会对多糖溶液中的多糖和糖醛酸产生吸附作用，进而造成多糖和糖醛酸的损失[22]．选择无水CaCl2的添加量为0.30g作为最佳处理条件．

2.3 盐酸法

pH对蛋白去除率、多糖保留率、糖醛酸保留率的影响如图3所示．由图3可知：随着pH的升高，蛋白去除率略有波动，但均较高，在pH＝3时，蛋白去除率最大，为95.92%；随着pH的增大，多糖保留率先增加后减小，在pH＝3时，多糖保留率最高，为86.31%，这可能是由于多糖在强酸条件下发生了水解[23]．糖醛酸保留率受pH的影响较大，在pH＝1时，糖醛酸保留率为59.27%，但pH＝3时，糖醛酸保留率达到了95.03%，这可能是由于糖醛酸在剧烈的水解条件下很容易发生脱羧反应．故盐酸法除蛋白的最适pH为3．

图3 pH对蛋白去除率、多糖保留率、糖醛酸保留率的影响Fig. 3 Effect of pH on protein removal rate，polysaccharide retention rate and uronic acid retention rate

2.4 3种脱蛋白方法的比较

将3种脱蛋白方法在各自最优条件下获得的数据进行对比，结果如图4所示．

图4 TCA法、盐析法、盐酸法脱蛋白结果比较Fig. 4 Comparison ofthe results of deproteinization by TCA method，salting out method and hydrochloric acid method

从图4中可以看出：用无水氯化钙盐析脱蛋白的效果最差，它对蛋白的去除率低，对多糖和糖醛酸的保留率差；TCA法和盐酸法脱蛋白的效果都较好，在最优条件下蛋白去除率都达到95.00%以上，两种方法对多糖都有较好的保留效果，TCA法中糖醛酸保留率更高一些，最优条件下达到98.67%．

2.5 紫外光谱分析

不同样品的紫外光谱如图5所示．从图5中可以看出：脱蛋白样品和未脱蛋白样品的紫外光谱有明显的区别．蛋白因氨基酸残基中的苯环上有共轭双键而在280nm处对紫外有吸收[24]，故而样品扫描光谱在280nm处有吸收峰．扫描曲线的结果显示，在280nm前后，3种脱蛋白方法处理的样品相对于未脱蛋白的样品没有明显吸收峰，表明这3种脱蛋白方法都有明显脱除蛋白的效果．

图5 不同样品的紫外扫描光谱Fig. 5 UV scanning spectra of different samples

3 结 论

TCA法、盐析法、盐酸法对银条菜粗多糖都有较好的脱蛋白效果．TCA法在TCA溶液体积分数为5.00%时，蛋白去除率为97.25%；盐析法中无水氯化钙的添加量为0.30 g时，蛋白去除率为90.61%；盐酸法调节pH为3时，蛋白去除率为95.92%；3种方法相应的多糖保留率分别为86.89%、83.59%、86.31%，糖醛酸保留率分别为98.67%、88.67%、95.03%．故而在这3种脱蛋白方法中TCA法的效果最好，盐酸法次之，盐析法的效果最不理想．由此证明TCA 法是一种能够相对有效去除银条菜多糖中蛋白且多糖和糖醛酸保留较好的一种方法．