超声辅助响应面法优化种植佛手中橙皮苷和柚皮苷提取工艺的研究

王向平，张建海，冯彬彬

（1重庆三峡医药高等专科学校，重庆 404120；2河南省洛阳市洛龙区农林技术推广站，河南 洛阳 471023）

0 引言

佛手为芸香科植物佛手（Citri medica var.sarcodactylis）的干燥果实[1-2]，为中国传统的药食两用药材，具有疏肝理气、和胃止痛、燥湿化痰的作用，一般用于治疗肝胃气滞、胸胁胀痛、胃脘痞满、食少呕吐、咳嗽痰多等疾病。佛手中主要的化学成分为多糖类、黄酮类、挥发油、香豆素、无机元素、氨基酸及维生素等[3-5]，其中药效成分多为黄酮类。佛手总黄酮的提取研究涉及广东、广西的广佛手、浙江的金佛手以及四川的川佛手较多。邓祥等[6-7]研究了川佛手中黄酮类物质的微波和超声波联合提取工艺及超临界CO2流体萃取技术，在最佳提取工艺条件下，川佛手总黄酮的提取量和提取率分别约为44.05 mg/g和3.79%。章斌等[8-9]研究了复合酶法和超声提取广佛手总黄酮的工艺，佛手总黄酮得率分别为4.093%和3.22%。王晋、李宇浩等[10-11]进行了广佛手中黄酮提取工艺的优化。已有研究发现，不同产地、不同的提取方法对佛手黄酮提取影响较大[12-14]。超声波辅助提取法是利用超声波产生的强烈振动、高加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等[15-16]，加速有效成分进入溶剂，从而提高浸出率，缩短提取时间。它可降低处理温度，提高果胶提取率，具有操作方便、品质稳定等优点[17-18]。响应面分析法作为一种有效的试验设计方法，可进行多因素多水平研究，并可研究因素间的交互作用，根据综合指标得到最优化的工艺结果[19-21]。为了提高佛手中橙皮苷和柚皮苷提取率，本研究根据有关资料和预试验的结果，对万州种植佛手药材的提取工艺进行了改良，主要利用超声波辅助提取万州种植佛手中橙皮苷和柚皮苷，并通过Box-Behnken试验和响应面分析法优选提取工艺，为万州种植佛手进一步开发利用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

HH.SYZ1-NI型电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司），DGX-9143B-1型数显鼓风干燥箱（上海福玛实验设备有限公司），SHB-IV双A循环式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），KQ5200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），液相色谱仪（美国Agilent1260），BSA224S电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司），Millipore纯水系统。

1.2 试剂和药品

橙皮苷、柚皮苷对照品购自中国食品药品检定研究院，批号分别是110721-201818、110722-201815。乙腈、甲醇为色谱纯，试验用水为去离子水，其他试剂均为分析纯。

万州种植佛手，经重庆三峡医药高等专科学校张建海教授鉴定为芸香科植物佛手Citri medica var.sarcodactylis的干燥果实。

1.3 试验设计

1.3.1 提取工艺单因素试验 以橙皮苷、柚皮苷提取率为指标，选取超声提取时间（10、15、20、25、30、35、40 min）、佛手与乙醇的质量比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40）、乙醇体积分数为（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）、超声提取温度（40、45、50、55、60、65、70℃）进行单因素试验，研究各因素对橙皮苷、柚皮苷提取率的影响并确定最佳提取工艺参数。

1.3.2 提取工艺响应面试验 在单因素试验所得数据基础上，根据Box-Behnken组合试验的设计理论，选取超声提取时间（A）、乙醇体积分数（B）、超声提取温度（C）、佛手与乙醇的质量比（D）对橙皮苷、柚皮苷提取率影响显著的4个因素进行响应面试验方案设计。

1.4 标准曲线的建立及样品测定

1.4.1 色谱条件和系统适应性试验 色谱柱Agilent-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-冰醋酸（33:63:2）为流动相；流速1.0 mL/min，温度25℃，检测波长284 nm，进样量20 μL。理论板数按橙皮苷和柚皮苷峰计算应不低于5000。

1.4.2 对照品溶液的制备 分别取橙皮苷对照品和柚皮苷对照品各5.5 g，精密称定，加甲醇制成分别含216.67 μg/mL橙皮苷和柚皮苷的溶液。

1.4.3 供试品溶液的制备 取本品粉末（过五号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.4.4 标准曲线的建立 分别取1.4.2项下橙皮苷和柚皮苷对照溶液1.5、3、6、12、24、48、96 µL，将橙皮苷和柚皮苷储备液配制成质量浓度均为3.25、6.50、13.00、26.00、52.00、104.00、208.00 µg/mL的系列标准溶液，按1.4.1项下中的色谱条件进行HPLC分析。

1.5 数据处理

采用Excel和Design-Expert.8.0.6等试验软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 万州种植佛手单因素试验考察

2.1.1 超声波提取时间单因素考察 取万州种植佛手粉末1.0 g，精密称定，固定乙醇体积分数75%，超声提取温度65℃，佛手与乙醇的质量比1:20，超声提取时间分别为10、15、20、25、30、35、40 min。结果（图1）显示，橙皮苷含量分别为0.0301%、0.0310%、0.0315%、0.0324%、0.0321%、0.0316%、0.0314%，柚皮苷含量分别为0.0315%、0.0317%、0.0326%、0.0342%、0.0343%、0.0339%、0.0335%，综合考虑选择25 min超声提取时间为最佳。

图1 超声波提取时间对橙皮苷和柚皮苷含量的影响

2.1.2 佛手与乙醇的质量比单因素考察 取万州种植佛手粉末1.0 g，精密称定，固定乙醇体积分数75%，超声提取时间25 min，超声提取温度65℃，佛手与乙醇的质量比分别为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40进行提取。结果（图2）显示，橙皮苷提取的百分含量分别为0.0251%、0.0311%、0.0352%、0.0355%、0.0353%、0.0351%、0.0354%，柚皮苷的含量分别为0.0231%、0.0296%、0.0336%、0.0335%、0.0337%、0.0338%、0.0337%，综合考虑选择佛手与乙醇的质量比1:20为最佳。

图2 佛手与乙醇的质量比对橙皮苷和柚皮苷含量的影响

2.1.3 乙醇体积分数单因素考察 取万州种植佛手粉末1.0 g，精密称定，超声提取时间25 min，超声提取温度65℃，佛手与乙醇的质量比1:20，乙醇体积分数分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液提取。结果（图3）显示，橙皮苷提取的百分含量分别为0.0215%、0.0227%、0.0237%、0.0258%、0.0282%、0.0321%、0.0325%，柚皮苷的含量分别为0.0231%、0.0263%、0.0297%、0.0325%、0.0338%、0.0342%、0.0337%，综合考虑选择80%乙醇为最佳。

图3 乙醇体积分数对橙皮苷和柚皮苷含量的影响

2.1.4 超声提取温度单因素考察 取万州种植佛手粉末1.0 g，精密称定，固定乙醇体积分数80%，超声提取时间25 min，佛手与乙醇的质量比1:20，分别于40、45、50、55、60、65、70℃进行提取。结果（图4）显示，橙皮苷提取的百分含量分别为0.0256%、0.0263%、0.0289%、0.0298%、0.0341%、0.0338%、0.0337%，柚皮苷的含量分别为0.0283%、0.0297%、0.0314%、0.0352%、0.0349%、0.0345%、0.0347%，综合考虑选择超声提取温度60℃为最佳。

图4 超声提取温度对橙皮苷和柚皮苷含量的影响

2.2 提取工艺优选

基于万州佛手单因素提取工艺试验结果，根据各因素的特点及影响程度，选择超声提取时间（A）、乙醇体积分数（B）、超声提取温度（C）、佛手与乙醇的质量比（D）为自变量，中水平分别为25 min、60℃、80%、1:20，采用4因素3水平Box-Behnken Design试验设计[21]，因素水平见表1，试验安排及结果见表2。

表1 Box-Behnken试验因素水平

表2 Box-Behnken试验及结果

续表2

2.3 橙皮苷和柚皮苷标准曲线的建立

根据1.4.4项下HPLC分析，以峰面积y对质量浓度x进行线性回归，得橙皮苷回归方程y=33.838x+17.776（R2=0.9998），柚皮苷回归方程y=60.635x+56.247（R2=0.9997），线性范围3.25～208.00 µg/mL。

2.4 样品测定

按照设计的试验条件提取橙皮苷和柚皮苷，取各试验设计供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定即得，结果见表2，响应面分析结果见图5，方差分析结果见表3。

从表3方差分析可知，对橙皮苷来说，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2为显著性影响因素。在各影响因素中，佛手与乙醇的质量比（D）的影响因素最大，其次超声提取温度（C）、乙醇浓度（B）和超声提取时间（A）。在所有的作用因素中，平方项和1次项的系数对橙皮苷含量的影响较大，而交互项对橙皮苷含量影响相对较小，在交互项中，影响最大的是AD，影响最小的为AC；对柚皮苷含量提取来说，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2为显著性影响因素，影响最大的是A2，影响最小的是C。在各影响因素中，乙醇浓度（B）的影响因素最大，其次是佛手与乙醇的质量比（D）、超声提取时间（A）、超声提取温度（C）。在总的作用因素中，平方项和一次项的影响较大，而交互项项影响相对较小，在交互项中，影响最大的是AC，影响最小AB。

以万州种植佛手中橙皮苷和柚皮苷含量为响应值，采用Design-Expert 8.0.6.1软件对表2试验数据进行三元二次多项式逐步回归拟合，得回归方程Y=0.0689+0.003733A+0.003783B+0.005025C+0.006092D-0.001700AB+0.0007500AC+0.002700AD+0.001525BC+0.001925BD+0.002600CD-0.0159A2-0.0154B2-0.0164C2-0.0148D2、Y=0.079+0.004700A+0.006267B+0.003450C+0.005283D-0.0003750+0.003475AC+0.001500AD+0.002675BC+0.002650BD+0.001300CD-0.021A2-0.018B2-0.020C2-0.020D2。由表3和回归方程可以看出，该模型高度显著，与实际试验拟合较好，能很好地描述试验结果。为更直观地表现各因素对橙皮苷和柚皮苷提取量的相互关系，拟进行响应面分析，结果见图5，从结果看出，各因子之间交互效果不显著，但是有一定的相互作用，并且既有正相关也存在着负相关。

表3 回归方程方差分析

图5 超声提取时间、乙醇浓度、超声提取温度和料液比对橙皮苷和柚皮苷的影响的响应面

验证试验通过Design Expert V8.0.6.1软件进行响应面设计优化，确定橙皮苷和柚皮苷含量最佳提取工艺条件为超声提取时间26.3 min、乙醇体积分数81.5%、超声提取温度61.7℃、佛手与乙醇的质量比1:21.9，则橙皮苷和柚皮苷提取的最大量为0.0705%和0.0808%。结合实际操作考虑，将工艺条件修正为超声提取时间26 min、乙醇体积分数82%、超声提取温度62℃、佛手与乙醇的质量比1:22（g/mL）。按该工艺进行5次验证试验，结果万州区种植佛手和浙江佛手橙皮苷和柚皮苷含量如表4，与预测值基本一致，表明该三元二次方程与实际情况拟合较好，充分验证了所建模型的正确性。

表4 不同产地佛手中橙皮苷和柚皮苷含量（n=5） %

3 讨论与结论

超声波提取分离主要是依据物质中有效成分和有效成分群体的存在状态、极性、溶解性等设计的一种方法。合理利用超声波振动的方法进行提取的新工艺，使溶剂快速地进入固体物质中，将其物质所含的有机成分尽可能完全地溶于溶剂，得到多成分混合提取液。利用超声波技术来强化提取分离过程，可有效提高提取分离率，缩短提取时间、节约成本，甚至还可以提高产品的质量和产量。本方法可较好地应用于万州种植佛手有效成分的提取，其主要药效成分可较好保留。在整个提取过程中温度较低，有利于万州种植佛手中的有效成分不被破坏。

在单因素试验基础上，确定超声提取时间、乙醇体积、超声提取温度、液固比对万州佛手橙皮苷和柚皮苷提取率影响显著，采用响应面法对超声辅助提取万州种植佛手中的橙皮苷和柚皮苷工艺条件进行优化，结果预测值与实测值基本一致，说明建立的工艺条件可靠，能有效提高万州种植佛手中的橙皮苷和柚皮苷的提取率，对万州种植佛手资源的综合利用及工业生产具有指导意义。

本试验利用响应曲面法优化了从万州种植佛手提取橙皮苷和柚皮苷的4个关键因子，得到二次项回归模型，并对交互项作用进行分析。确定最佳工艺条件为超声提取时间26 min、乙醇体积分数82%、超声提取温度62℃、佛手与乙醇的质量比1:22（g/mL）。