不同激素处理对白桦幼树萌条及三萜合成的影响

张玉琦 苏 欣 尤志强 富金博 詹亚光，2 尹 静，2*

（1. 东北林业大学东北盐碱地植被恢复与重建教育部重点实验室，哈尔滨 150040；2. 东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040）

白桦（Suk.）中含有重要的次级代谢产物白桦脂醇，白桦脂酸和齐墩果酸等五环三萜类化合物，它们具有广泛的药理活性，在抗癌、抗人类免疫缺陷病毒（HIV）及治疗心血管疾病方面发挥重要作用。最近发现白桦脂酸对多种肿瘤具有抑制效果，包括人神经胶质瘤、白血病、人结肠癌、人前列腺腺癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、乳腺癌和宫颈癌。口服齐墩果酸具有抗胆汁淤积作用，也可以用作治疗人肝细胞癌的治疗剂。

然而，随着天然药物需求的增长，药用植物资源变得越来越稀缺，特别是以多年生树木组织作为来源的活性成分，含量及产量更是有限，成为进一步应用的瓶颈。本实验室前期已对白桦三萜积累规律、分布特征、细胞培养、诱导调控及相关基因功能等做了一系列的研究，并取得一定进展。但关于白桦幼苗进行萌条实验还未曾尝试。之前对木本植物萌芽再生的研究已有一些报道，其中大多数主要集中在发芽机理上，其中包括6 个假说：生物地理假说、生境假说、营养假说、干扰假说、资源分配假说和激素调控假说，也有研究速生多用途固氮树种马占相思（Willd.）树桩性状（如基径和高度）对发芽存活和生长的影响，如伐桩的萌芽率及平均萌条数随伐桩高度的增加而增加，随直径的增大而减少。萌条直径、长度及直立萌条总断面积随伐桩的高低和大小而增减。几种常绿阔叶林优势种在砍伐后萌枝更新的初步研究结果显示，砍伐对木荷（）、石栎（）、苦槠（）、栲树（）、米槠（）萌芽更新都会造成影响，对栲树、米槠影响更大，而对木荷、石栎、苦槠影响较小。从植物萌生角度来说，这是形成研究地区大面积的以木荷、石栎、苦槠为优势种组成的次生灌丛的主要原因。有研究证实春季（3月）对麻疯树（L.）树干基部进行截干处理可达最佳的优树促萌效果。第2 年春对南酸枣（）截干处理造林效果较好。通过不同种植密度和截干高度的栽培试验，银杏（L.）叶用林以种植密度100 cm×40 cm 及离地50 cm 截干的鲜叶产量最高。沙棘（）最佳的促萌造林时间为春秋两季，同时又有实验证明杨树（cv.）根系具有连续多年多次萌发的能力。黄利斌等用0.2% KMnO诱导杉木（（Lamb.）Hook.）促 萌 与对照相比萌条数量增加效果显著。苏广新等以湿加松（var.Engelm ×Morelet）F2 代为研究对象，对湿加松进行修剪促萌试验研究，发现修剪效果最佳方式为主茎留高约l0 cm 进行截干。吴幸连对桉树（）进行促萌研究，发现距根茎部位20 cm 处的截干促萌效果显著。截干促萌复壮技术也应用于油茶（Abel.）低产林，增产效果极佳。研究发现马尾松（Lamb.）剪顶促萌高度在8 cm 为宜。研究发现6-BA、KT对提高柚木（L.f.）无性系的萌芽数和穗条量效果显著，采用剪除柚木萌条仅留1对叶片的处理效果极佳。本研究以1 年生白桦幼苗为试材，通过不同截干高度、基部保湿、激素促萌处理，探明不同处理下白桦幼苗萌条效果及对三萜合成的影响，以期为持续、高效、稳定地获得白桦材料及次生产物有效生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

白桦于2013年10月温室育苗，采用直径10 cm，高15 cm塑料盆，盆栽用土为（黑土）∶（草炭土）∶（沙）=3∶1∶1，1株/盆，育苗400株。2014年5月，株高达50～60 cm，选取生长一致、均匀的幼苗进行促萌处理。

1.2 实验方法

1.2.1 不同截干高度处理

采用3 个截干高度：10、20 和30 cm 以及一组不截干（对照）处理。12 次（株）重复，2014 年5 月12 日按3 个不同截干高度进行截干处理，塑料膜密封截干伤口，统计初始芽点数量，截干后充足浇水，此后定期等量浇水，30 d 进行促萌结果统计，包括萌芽数量及萌条数量，计算萌芽率和萌条率。

1.2.2 基部保湿处理

采用3 个截干高度处理：10、20、30 cm 处理后，在基部覆盖锯末10 cm厚度，并浇水保湿促萌。统计初始芽点数量。12 株重复，一个月后统计萌芽数及萌条数量。

1.2.3 激素或药剂促萌处理

采用3 个截干高度：10、20、30 cm 处理后，每个截干高度使用4 种激素或化学药剂处理：2，4-D（20 mg·L）、KT（20 mg·L）、6-BA（20 mg·L）和KMnO（20 mg·L）。2014 年5 月12 日按上述试剂浓度，在截干的苗茎上使用大毛笔涂抹处理，每个处理12株，统计初始芽点数量，一个月后统计萌芽数量及萌条数量。

1.2.4 留条方式及二、三次促萌试验

上述不同截干及药剂促萌试验1个月后，进行萌条数量统计，同时进行不同留条试验及二次促萌试验，在二次促萌试验1 个月后，再进行第3 次促萌。

留条方式：在截干1 个月采条时，在离最低腋芽5 cm 处剪去萌芽条，即留一对叶片，1 个月后进行萌条数量统计。

1.3 试验指标观测

1.3.1 数据收集与统计分析

使用1 年生白桦苗，2014 年5 月12 日开始进行截干处理。截干前进行苗高、地径的生长调查。

截干及激素处理后立即对腋芽原基数进行调查，然后在截干后1个月（第1次采条）、2个月（第2次采条）、3 个月（第3 次采条）时对可采穗条数调查。

根据调查的腋芽原基数量、萌芽数量和可采穗条数量计算：腋芽原基转化率是指腋芽原基转化成芽和可采穗条的百分率。

穗条可采率是指采集穗条时可采穗条数量占萌芽数量的百分率。

利用DPS7.05软件对试验数据进行分析。

1.3.2 总三萜的提取及含量测定

白桦总三萜含量检测参考本实验室之前研究方法方法。

1.3.3 白桦脂醇、白桦脂酸、齐墩果酸样品的制备及检测

白桦脂醇、白桦脂酸、齐墩果酸提取方法及检测方法参考本实验室之前的方法进行。

2 结果与分析

2.1 不同促萌方式对白桦苗萌条产量及三萜合成的影响

白桦幼苗初次截干（30 d 后）促萌采条结果表明：截干高度为10 cm 的植株萌芽率达40%，萌条率达70%，萌条产量达32.13 g。萌芽率、萌条率高于截干高度为20和30 cm处理组（见表1）。

由表1 可知，相同截干高度不同药剂处理下，截干高度为10 cm 的植株中，KT 激素处理的萌芽率最高达69.12%，锯末处理的萌条率最高达77.78%，锯末处理的萌条产量也为最高，达61.34 g；截干高度为20 cm 的植株中KMnO激素处理的萌芽率最高，达40.91%，2，4-D 处理的萌条率最高达62.86%，锯末处理的萌条产量最高为77.18 g；截干高度为30 cm 的植株中KT激素处理的萌芽率最高，锯末处理的萌条率最高达75%，KMnO处理的萌条产量最高；说明KT 有利于白桦苗芽点的萌发，2，4-D 有利于白桦的萌条，锯末处理有利于萌条率和萌条产量的增加。本实验确定了截干高度10 cm 进行激素KT 处理的白桦苗萌芽率最高，达69.12%；截干高度10 cm的锯末处理下白桦萌条率最高；截干高度20 cm，锯末处理下白桦鲜质量为最高，达77.18 g。

表1 初次促萌采条白桦苗萌条产量Table 1 Sprout yield of birch seedlings

图1 白桦苗初次促萌（30 d）Fig.1 Birch seedlings for first rafting branch

初次促萌采条白桦幼苗枝条总三萜含量以截干高度20 cm 最高，达76.43 mg·g（见图2A），其次为截干高度10 cm枝条中有较高三萜含量，其他处理均不利于总三萜积累。叶中总三萜含量以截干高度30 cm 下激素6-BA处理最高，达91.16 mg·g，是截干高度30 cm 下锯末处理的2.68 倍（见图2B），另外不同截干高度下的2，4-D 处理没有显示出对叶中三萜积累有显著抑制作用。锯末处理、KT 和KMnO处理下的枝条和叶片中总三萜含量也显著低于其他处理，其中锯末处理下总三萜含量均最低。

图2 白桦苗促萌初次采条枝条（A）和采条叶（B）中总三萜含量注：小写字母表示在0.05水平差异显著，下同Fig.2 Content of total triterpenoids in branche（sA）and leave（sB）of birch seedlings for first rafting branchNote：Small letter means significant difference at 0.05 level，the same as below

初次促萌后截干高度为20 cm 下6-BA 处理，提高了枝条中白桦脂醇含量，显著高于其他处理（图3A）。叶中白桦脂醇含量以截干高度30 cm 进行激素6-BA 处理最佳，达到22.70 mg·g（见图3B），其次为截干高度30 cm 和截干高度30 cm 进行2，4-D 处理。表明6-BA 可显著促进促萌枝条和叶中白桦脂醇的积累。同时发现KMnO和锯末保湿处理并不利于白桦枝条和叶片中三萜物质的积累。

图3 白桦苗初次促萌采条枝条（A）和采条叶（B）中白桦脂醇含量Fig.3 Betulin content in branches（A）and leaves（B）of birch seedlings for first rafting branch

初次截干采条后，白桦枝条中白桦脂酸含量以截干高度20 cm 下激素6-BA 处理含量最高（见图4A），其次为相同截干高度不加激素处理的组，截干高度20 cm，30 cm 下进行2，4-D 处理的枝条中均表现较高白桦脂酸含量。

图4 白桦苗初次促萌采条枝条（A）和采条叶（B）中白桦脂酸含量Fig.4 Content of betulinic acid in branches（A）and leaves（B）of birch seedlings

叶中白桦脂酸含量以不加激素的三种截干处理及激素6-BA、2，4-D 处理表现较高，显著高于其他处理（见图4B）。而锯末处理、KT 处理及KMnO均不利于白桦脂酸含量积累。

截干高度为20 cm 的枝条中齐墩果酸含量较高，为17.90 g，而截干高度为30 cm 叶中齐墩果酸含量较高，为20.96 g。初次促萌采条白桦幼苗枝条齐墩果酸含量以截干高度20 cm 进行激素6-BA处理含量最高，达18.95 mg·g（见图5A），其次为截干高度20 cm 和KMnO处理的10 cm 截干高度枝条中均表现较高齐墩果酸含量。叶中齐墩果酸含量以截干高度30 cm 进行激素6-BA 处理最佳，达21.96 mg·g（见图5B），其次为截干高度30 cm和20 cm 叶中均表现出较高齐墩果酸含量。表明截干高度30 cm 的6-BA 处理对齐墩果酸的积累有利，其他处理均不利于叶片中齐墩果酸积累。

单因素分析结果显示，年龄、科室、本单位工作年限、“是否主动了解疫苗相关知识”“近3年是否接触过自费疫苗”与知识得分有关（Z/H=6.512、-2.177、14.243、-3.378 和-3.169； P 均＜0.05）。Logistic回归分析显示，医务人员“近3年是否接种自费疫苗”和“是否主动了解疫苗相关知识”是知识得分分组的影响因素。见表3。

图5 白桦苗初次促萌采条枝条（A）和采条叶（B）中齐墩果酸含量Fig.5 Content of oleanolic acid in branches（A）and leaves（B）of birch seedlings

2.2 二次促萌对白桦苗萌条产量及总三萜合成的影响

在第一次截干采条后，一个月再进行二次截干处理。结果表明，截干高度为10、20、30 cm的植株中，锯末处理的萌条数量和鲜质量都高于其他处理，萌条产量分别为126.96、59.78 和58.65 g（见表2）；其他处理未见比对照有显著提高，该结果进一步说明锯末处理有利于二次萌条及产量的提高。

表2 二次促萌白桦萌条产量Table 2 Sprouting shoot yield of birch

二次促萌白桦枝条总三萜含量以截干高度20 cm 进行激素6-BA 处理效果较好，达97.55 mg·g（见图6A），其次为截干高度30 cm 进行KMnO处理及截干高度10 cm 进行6-BA 处理。KT、锯末处理及2，4-D 处理未表现出对二次促萌枝条中三萜含量有促进作用。

图6 二次促萌白桦枝条（A）和采条叶（B）中总三萜含量Fig.6 Total triterpenoids content in branches（A）and leaved（B）for secondary sprouting of birch

叶中总三萜含量以截干高度20 cm 进行激素KT 处理最佳，达99.22 mg·g（见图6B），其次锯末处理组、6-BA处理组叶中也有较高总三萜含量。

2.3 三次促萌对白桦苗萌条产量及总三萜合成的影响

由表3 可知，对白桦苗进行三次促萌处理后，截干高度为20 cm 的植株中，2，4-D 处理的萌条数量最高达27，锯末处理的萌条产量最高；截干高度为30 cm 的植株中，KT 处理的萌条数量最高，2，4-D处理的萌条产量最高，达18.56 g；说明KT、2，4-D和锯末有利于三次萌条。

表3 三次促萌白桦萌条产量Table 3 Sprouting yield of birch seedlings of third sprouting promotion

第二次截干促萌后1 个月，进行第三次采条，收集白桦枝条和叶片，检测总三萜含量，结果表明：第三次促萌后采条总三萜含量以截干高度30 cm 进行激素6-BA 处理最高，达97.99 mg·g（见图7A），其次为截干高度20 cm 进行KMnO处理及截干高度30 cm 进行2，4-D 处理的枝条中有较高三萜含量。三次促萌采条后，枝条中以对照组及锯末处理组的总三萜含量较低。

图7 三次促萌白桦枝条（A）和采条叶（B）总三萜含量Fig.7 Total triterpenoids content in branches（A）and leaved（B）for third times sprouting promoting birch

叶中总三萜含量以截干高度10 cm 进行激素2，4-D 处理最佳（见图7B），其次为截干高度20 cm及截干高度20 cm进行锯末处理，叶中有较高三萜含量。激素6-BA、KMnO处理组叶片中总三萜含量较低。

3 讨论

白桦为落叶乔木，成年白桦树外皮中含有丰富的抗肿瘤活性成分五环三萜类物质，但树木生长周期长，三萜物质来源有限，成为大规模实际应用的瓶颈。本文在不同截干高度下利用不同激素处理白桦幼苗，以探索一种可持续、稳定的获得白桦枝条及三萜物质的方法。已有研究结果表明，截干能够促进南方红豆杉（var.）地径生长及茎干上潜伏芽的萌发，且留干较长的萌蘖数量较多；截干能够促进新枝萌发，且留干较短对新枝萌发数量有促进作用。同时也有研究显示，为了缩短非生产期，国营东平农场曾尝试用高截干橡胶（）作定植材料，在早春定植。紫穗槐（L.）截干造林的成活率、新梢生长量、发枝量、冠幅生长量及次年保存率均优于小苗造林，沙荒地效果更明显，截干以在30 cm 左右饱满芽处为最佳高度。可见，木本植物截干处理可以改变株型，获得丰富的枝条。

激素处理对于枝条萌发及次生产物合成也具有重要的作用。6-BA（6-苄氨基嘌呤）的主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。6-BA 可抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质的分解，是高效能植物生长调节剂，在促进种子发芽、促进花芽分化、提高坐果率、促进果实生长、提高果品品质等多方面表现良好。KT 即激动素，其主要是用来诱导芽的分化，促进侧芽发生，抑制衰老，促进植物生长，具有与生长素（IAA）相似的生理效应，低浓度时可以促进植株的生长。植物生长调节剂GA 和6-BA 对岑软3 号油茶（Abel.）扦插苗芽眼的萌发有明显的促进作用，6-BA 500 mg·L、1 000 mg·L、1 500 mg·L喷 雾、GA 2 000 mg·L喷雾和醮芽、GA 3 000 mg·L醮芽6个处理的萌芽率均显著高于对照，萌芽率最高的是6-BA 1 500 mg·L喷雾。生产上宜采用6-BA 1 500 mg·L喷雾的方法来进行油茶（Abel.）促萌。采用不同药剂KT、2，4-D 等处理一年生水曲柳（Rupr.）去顶芽的苗木，可获得大量萌条。当NAA 浓度一定时，培养基中添加6-BA 比KT 更利于烟草（）叶片不定芽的分化。在MS 悬浮培养基中加入6-BA、2，4-D 和KT 后，显著增加了青钱柳（）中熊果酸和齐墩果酸的含量。本研究发现，截干10 cm，6-BA、KT 处理能够提高白桦萌芽率和萌条产量；同时6-BA 相比其他激素处理对三萜类次生代谢产物合成有更显著的调节效应，这一点与前人结果有相似之处。

4 结论

本实验以白桦1年生幼苗为试材，通过不同截干高度、激素及基部保湿处理进行促萌，结果显示：通过三次促萌对比发现，二次促萌效果最佳。其中白桦枝条中总三萜含量以截干高度20 cm 的6-BA 处理最佳。叶中总三萜含量以截干高度20 cm 进行激素KT 处理最佳。HPLC 检测结果显示，一次促萌后，相比其他激素和锯末处理，6-BA 和2，4-D 对白桦脂醇、白桦脂酸、齐墩果酸的合成有显著促进作用。其中，截干高度20 cm的6-BA枝条中三种成分含量分别为17.77、2.30、18.55 mg·g。叶中含量分别为21.64、3.03、21.56 mg·g。KT、2，4-D和锯末有利于第三次萌条产量的提高。

通过分析发现6-BA、KT 及2，4-D 对促萌后枝条和叶片中总三萜及其三萜组分合成有明显调节作用，可考虑在生产中针对白桦幼苗及不同截干处理，进行三种激素的适宜浓度处理，有效增加采条数量和三萜物质的产量。该研究为可持续、高效地利用白桦资源及获得活性三萜产物提供了技术支持。