UHILIC-MS/MS同时测定栝楼桂枝颗粒中22个氨基酸的含量

蒋昆霞，朱美玲，王雅心，陈小婷，林羽，许文*，徐伟*

(1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学生物医药研发中心，福建 福州 350122)

栝楼桂枝汤源自张仲景的《金匮要略》，福建中医药大学陈立典教授结合多年的临床经验，将栝楼桂枝汤应用于脑卒中后的康复取得良好的疗效，目前该复方的颗粒剂栝楼桂枝颗粒经院内制剂新药申报批准为福建省第二人民医院制剂(批件号：闽2013S0001)，主要用于脑卒中后肢体痉挛及康复治疗[1-2]。现代药理研究表明，还可用于治疗缺血性脑卒中、癫痫、脊髓损伤后的肢肉痉挛等[3-5]。

现代药理学研究表明栝楼桂枝颗粒可以通过调控神经抑制性氨基酸——γ-氨基丁酸(GABA)受体发挥改善脑卒中后痉挛作用[6]，也可以调节兴奋性氨基酸及其受体的表达，改善MCAO大鼠模型大鼠的神经损伤[7]，代谢组学研究显示栝楼桂枝汤可以改善体内氨基酸代谢异常[8]。提示栝楼桂枝颗粒中氨基酸类成分可能与其在体内调控神经调控相关的氨基酸受体有关，尤其君药栝楼根富含多种氨基酸类化合物[9]。

目前复方中关于氨基酸类化合物的分析方法主要采用高效液相色谱(HPLC)法[10-13]，由于氨基酸属于强极性成分，在普通反相色谱上往往难以保留，常规HPLC方法的样品前处理相对较复杂，往往需要进行柱前衍生，但是分析测定时容易受到衍生剂的稳定性以及衍生速度的影响，导致测定方法的灵敏度不高，难以满足对中药复方样品进行快速、高灵敏度和高通量的分析要求。近几年，随着现代色谱-质谱分析技术的发展，超高效亲水作用色谱，越来越多的用于中药复方中强极性成分的分离，通过串联质谱可高效的应用于中药复方中复杂体系的分析[14-15]。因此，本文通过建立一种超高效亲水作用色谱串联三重四极杆质谱法(UHILIC-MS/MS)对栝楼桂枝颗粒中22种氨基酸类成分进行无衍生化的快速含量测定，从氨基酸角度探讨栝楼桂枝颗粒抗脑卒中发挥神经保护作用的药效物质基础提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Xevo TQS三重四极杆质谱(美国Waters公司)；CPA225D型十万分之一分析天平(德国Sartorius公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。

1.2 试药 甲醇、乙腈(质谱纯，德国Merk公司)，甲酸(色谱纯，批号：F190210，阿拉丁试剂上海有限公司)，其余试剂均为分析纯。亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、异亮氨酸(Ile)、蛋氨酸(Met)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、苏氨酸(Thr)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)、组氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、缬氨酸(Val)，以上对照品均购自中国食品药品检定研究院，批号：140681-201703；γ-氨基丁酸(GABA,A104200)、羟脯氨酸(Hpro,H111005)、天冬酰胺(Asn,A105949)、门冬氨酸(Asp,I1412118)、瓜氨酸(Cit,C109228)、谷氨酰胺(Gln,G103978)均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氘代甘氨酸(D-Gly,TRC1599)购于加拿大Toronto Research Chemicals Inc公司，纯度均大于98%。栝楼桂枝颗粒来自福建省第二人民医院院内制剂。

2 方法与结果

2.1 色质谱条件

2.1.1 色谱条件 Waters ACQUITY UPLC BEH Amide (2.1 mm×100 mm,1.7 μm)，流动相：(0.25%甲酸+2 mmol·L-1甲酸铵)水(A)-乙腈(B)，亲水作用色谱梯度洗脱程序：0～2 min，8%A→8%A；2～3 min，8%A→35%A；3～4 min，35%A→45%A；4～4.1 min，45%A→8%A；4.1～6 min，8%A，进样量：1 μL，流速：0.4 mL·min-1，柱温：45 ℃。

2.1.2 质谱条件 电喷雾正离子模式；毛细管电压2.5 kV；脱溶剂气流：氮气800 L·h-1；脱溶剂温度：200 ℃；锥孔气流：氮气50 L·h-1；离子源温度：150 ℃；Extractor：3.00 V；碰撞气体：氩气。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 取Leu、Phe、Trp、Ile、GABA、Met、Val、Pro、Tyr、Ala、Hpro、Thr、Gly、Glu、Gln、Ser、Asn、Asp、Cit、Arg、Hit、Lys的对照品适量，精密称定，加入50%甲醇分别制备质量浓度为148.5、130.25、221.5、89.8、693.0、5.93、340.5、1 584、178.2、244.8、5.12、257.5、256.0、275.5、51.3、128.5、1 110、406.0、1 784、564、352.0、84.0 μg·mL-1的单一对照品储备液。分别精密量取上述对照品储备液适量至100 mL量瓶中，加入50%甲醇定容，即得以上成分的质量浓度分别为1 485、1 302.5、2 215、898、6 930、59.3、3 405、15 840、1 782、2 448、51.2、2 575、2 560、2 755、513、1 285、11 100、4 060、17 840、5 640、3 520、840 ng·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2 内标溶液 精密称定对照品氘代甘氨酸(D-Gly)适量，加入甲醇溶解并稀释至刻度，制备质量浓度为1.03 mg·mL-1的单一对照品储备液。精密量取上述对照品储备液适量至10 mL量瓶中，加入50%甲醇定容，即得质量浓度为1.03 μg·mL-1的内标溶液。

2.2.3 供试品溶液 取栝楼桂枝颗粒约0.5 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入50%甲醇100 mL，密塞，称量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称量，用超纯水补足失重，摇匀，0.22 μm滤膜滤过，取续滤液即得。用于定量分析的样品溶液：按1∶1(200,200 μL)加入内标溶液后进行测定。

2.3 方法学考察

2.3.1 质谱测定方法 采用正离子多反应监测(MRM)定量模式，22种分析物及内标的质谱分析条件参数见表1。混合对照品和栝楼桂枝颗粒样品(S1)在“2.1”项色谱及质谱条件下分析得栝楼桂枝颗粒的UHILIC-MS/MS的MRM色谱图(见图2)。结果表明22种分析物对照品与栝楼桂枝颗粒中所鉴定成分的色谱峰保留时间符合定性定量分析要求。

图1 各成分及内标物化学结构图1.Leu;2.Phe;3.Trp;4.Ile;5.GABA;6.Met;7.Val;8.Pro;9.Tyr;10.Ala;11.Hpro;12.Thr;13.Gly;14.Glu;15.Gln;16.Ser;17.Asn;18.Asp;19.Cit;20.Arg;21.Hit;22.Lys;IS.D-Gly

图2 空白溶液(A)、对照品(B)和栝楼桂枝颗粒样品(C)的UHILIC-MS/MS色谱图1.Leu；2.Phe；3.Trp；4.Ile；5.GABA；6.Met；7.Val；8.Pro；9.Tyr；10.Ala；11.Hpro；12.Thr；13.Gly；14.Glu；15.Gln；16.Ser；17.Asn；18.Asp；19.Cit；20.Arg；21.Hit；22.Lys;IS.D-Gly

图2(续)

图2(续)

表1 22个氨基酸及内标的质谱测定条件

2.3.2 线性和范围 取“2.2.1”项下方法制备的混合对照品溶液，用50%甲醇逐级稀释1、2、5、10、25、50倍系列梯度浓度的对照品混合溶液。按“2.1”项下条件测定峰面积，用峰面积与内标峰面积的比值(Y)对分析物质量浓度(X)进行线性回归，绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数，结果见表2。

表2 22种氨基酸的回归方程、线性范围以及相关系数

2.3.3 精密度试验 取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项条件1 d内连续进样6次及连续3 d重复进样(每天重复进样3次)测定，测定各成分和内标的峰面积，分别计算其峰面积比的RSD，其日内精密度和日间精密度结果见表3，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液(S1批次)，分别于0、2、6、10、12和24 h按“2.1”项下条件进样测定，测定各成分和内标的峰面积，求出峰面积比的RSD。结果见表3，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.5 重复性试验 精密称取同一批栝楼桂枝颗粒6份(S1批次)，按“2.1”项下条件进样测定，计算22个分析物的含量及其RSD，结果见表3，表明方法重复性良好。

表3 22个氨基酸的精密度、重复性、稳定性结果

2.3.6 回收率试验 精密称取“2.3.5”项下已测知含量的栝楼桂枝颗粒6份，约0.25 g，按近似1∶1质量浓度精密加入22种对照品溶液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件进样测定待测成分的量，计算回收率，结果见表4。

表4 栝楼桂枝颗粒中22种待测成分的回收率试验结果(n=6)

表4(续)

表4(续)

2.4 样品含量测定 分别精密称取0.5 g栝楼桂枝颗粒6批样品粉末各3份，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件进样测定峰面积，根据内标法计算各批次栝楼桂枝颗粒中22种化合物的含量，结果见表5。

表5 6批栝楼桂枝颗粒各成分的含量(mg·g-1,n=3)

3 讨论

本研究对22个氨基酸进行无衍生化的含量测定，首先色谱分离上，通过比较两种类型的HILIC柱，包括BEH Amid酰胺HILIC柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)和BEH 硅胶HILIC柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)，结果发现在相同的流动相中，前者对这些氨基酸类化合物的总体保留能力和分离度均优于后者；比较了流动相的不同添加剂，如甲酸铵、乙酸铵、甲酸、乙酸和氨水，结果显示，在水中添加0.25%甲酸和2 mmol·L-1甲酸铵可得到的最佳峰形。其次在质谱检测的优化上，发现大多数α-氨基酸均表现分子离子峰主要为[M+H]+峰，二级质谱上最佳子离子为结构中中性丢失一分子的甲酸，产生[M+H-HCOOH]+的子离子峰；而对于一些非α-氨基酸，如GABA，其子离子[M+H-NH3]+比[M+H-HCOOH]+丰度更高，最佳子离子为[M+H-NH3]+；另外含酰胺基团的氨基酸类化合物如Gln，能够同时产生m/z130[M+H-NH3]+，m/z101[M+H-HCOOH]+和m/z84[M+H-HCOOH-NH3]+的子离子峰，其中[M+H-HCOOH-NH3]+的丰度最大，所以选其最佳定量子离子为[M+H-HCOOH-NH3]+，最终在色谱和质谱条件的优化下，在6 min内使22个测定的氨基酸成分得到准确的定量。

氨基酸已被证实是脑卒中的重要代谢物之一[16]，兴奋性毒性损伤是缺血性脑卒中的主要发病机制之一[17]，脑缺血时神经抑制性氨基酸如GABA、瓜氨酸等具有神经保护作用[18-19]，临床研究发现缺血性脑卒中患者血清中组氨酸、甘氨酸、精氨酸、L-蛋氨酸、谷氨酰胺、L-瓜氨酸等发生改变[20]，提示氨基酸类成分在脑卒中调控中可能扮演重要角色，通过本次含量测定发现栝楼桂枝颗粒中氨基酸含量较高的成分为瓜氨酸(Cit)，含量范围达到2.78～4.29 mg·g-1，此外γ-氨基丁酸(GABA)、脯氨酸(Pro)、天冬酰胺(Asn)、精氨酸(Arg)含量也较高，均达到0.3 mg·g-1以上，而亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、蛋氨酸(Met)、酪氨酸(Tyr)、羟脯氨酸(Hpro)、谷氨酰胺(Gln)、丝氨酸(Ser)、赖氨酸(Lys)含量较低，均低于0.1 mg·g-1。

本研究所建立的UHILIC-MS/MS法，可快速准确的测定栝楼桂枝颗粒中22个氨基酸含量，该方法相比于已有的氨基酸分析方法，经简单的提取步骤即可制备样品溶液，可有效避免氨基酸衍生化所带来的弊端，方法可为快速测定中药复方中氨基酸类成分提供方法技术，为揭示栝楼桂枝颗粒中氨基酸类成分的物质基础奠定实验依据。