碳酸氢钠-连二亚硫酸钠还原法在敌草快和百草枯中毒快速检测中的应用及意义

周思江， 宁 宗， 谭兴领， 杨 霞

作为一种快速灭生性除草剂，联吡啶类除草剂因具有高效除草、不影响植物根部及地下茎等特点而被广泛应用于农业生产。但以百草枯(paraquat，PQ)为主的联吡啶类除草剂对人畜却有极强的毒性，且中毒后缺乏特效解毒剂，因此，中毒后病死率极高[1]。为减少中毒事件的发生，2016年7月国家农业部明确规定禁止使用百草枯水剂，但同属于联吡啶类除草剂的敌草快(diquat，DQ)因具有百草枯相似的化学结构而迅速在我国占据市场，成为继百草枯、草甘膦之后第三大灭生性除草剂，因此，中毒事件时有发生，发病率及病死率逐年升高[2-3]。百草枯和敌草快具有相似的化学结构，为减少临床误漏诊，本课题组前期研究结果[4]发现，采用高效液相色谱仪检测验证市场销售的所谓“敌草快”实乃百草枯，临床需警惕与敌草快中毒伴随的百草枯中毒。因此，如何快速、有效地鉴别敌草快与百草枯中毒，在临床迫在眉睫。

作为一种还原剂，碳酸氢钠-连二亚硫酸钠还原法具有操作简便、检验快速等特点，被临床上广泛应用于百草枯中毒的鉴别。敌草快与百草枯同属于联吡啶类除草剂，具有相似的化学结构，相关研究采用碳酸氢钠-连二亚硫酸钠还原法可以对尿液标本中敌草快进行快速判断[5]。但部分慢性肾衰竭无尿患者及由于样品从采集到检测的时间或保存的方式不同可能会发生偏差，鉴于此，本研究从采用血液标本的角度出发，首先予以高效液相色谱法检测敌草快与百草枯种类，进而借助于碳酸氢钠-连二亚硫酸钠还原法判断是否可以快速检测、评估、验证敌草快和百草枯中毒的可靠性，从而更好地服务于临床。

1 材料与方法

1.1实验材料与试剂

1.1.1 药品与试剂 98%敌草快标准品及98%百草枯标准品均购于麦克林公司；20%敌草快溶液(产自山东润扬化学有限公司)及20%百草枯溶液(产自肇庆市真格生物科技有限公司)均由广西化工产品质量检测站赠送；500 g/瓶连二亚硫酸钠(分析纯)购于麦克林公司；500 g/瓶碳酸氢钠(分析纯)购于天津市永大化学试剂有限公司；庚烷磺酸钠购于北京百灵威科技有限公司；磷酸及乙腈均购于成都市科龙化工试剂厂；甲醇购于瑞典欧普森色谱试剂公司；二氯甲烷购于天津市光复精细化工研究所。

1.1.2 主要仪器 LC-20AB高效液相色谱仪、SPD-20A UV-VIS Detector高灵敏度紫外可见光可变波长检测器、CTO-20AC Column Oven色谱柱恒温箱、SIL-20AC Autosampler自动进样器LC-20AB Solvent Delivery Unit溶液输送泵及Ver 1.25 Workstation工作站(均购于日本岛津公司)；灌胃器；离心机；电子天平；移液枪。

1.1.3 实验动物 家兔购于广西医科大学实验动物中心。伦理审查编号：202011008。

1.2方法

1.2.1 高效液相色谱法 对家兔灌胃用的20%敌草快、20%百草枯溶液进行定性及定量鉴定。

1.2.1.1 测定条件 色谱柱: ZORBAX300SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；检测波长:309 nm敌草快，258 nm百草枯；柱温35 ℃；流速1.0 mL/min；进样量20 μL；流动相庚磺酸钠3.64 g加入900 mL水，加16 mL磷酸，用8.0 mL三乙胺调pH=2加水至1000 mL，用0.45 μm滤膜过滤，超声10 min。

1.2.1.2 标准工作液配制 精密称取敌草快、百草枯标准品4.0 mg，分别用超纯水溶解并定量配制成质量浓度为4000 μg/mL。用超纯水逐级稀释,配制成质量浓度为160 μg/mL、80 μg/mL、40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL的百草枯和敌草快标准系列工作液。

1.2.1.3 样品处理 分别将20%敌草快溶液和20%百草枯溶液用超纯水稀释10 000倍后，经过滤后各取1 mL。

1.2.2 体外血清实验 称取3 mg敌草快标准品和3 mg百草枯标准品，分别溶于3 mL超纯水中，使其浓度为1 mg/mL敌草快溶液A和百草枯溶液B。将敌草快溶液A和百草枯溶液B分别稀释至浓度为4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL、20 μg/mL、35 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL各10管(1 mL/管)，分别标记为1A、2A、3A、4A、5A、6A、7A、8A、9A、10A及1B、2B、3B、4B、5B、6B、7B、8B、9B、10B。取1名健康志愿者血清20 mL，在以上每管中分别加入1 mL健康志愿者血清。对照组为分别为2管1 mL健康志愿者血清加入1 mL超纯水，标记为uA及uB。向uA、1A、2A、3A、4A、5A、6A、7A、8A、9A、10A及uB、1B、2B、3B、4B、5B、6B、7B、8B、9B、10B分别加0.4 g碳酸氢钠摇匀溶解后，加0.2 g碳酸氢钠-连二亚硫酸钠摇匀，待1 min充分显色后即对比并拍照，20 min后再次观察颜色变化并拍照。

1.2.3 动物体内实验 家兔随机分成两组(每组3只)1组为敌草快组，编号为a、b、c；2组为百草枯组，编号为d、e、f。分别在灌胃前从家兔耳缘动脉取血3 mL，3000 r/min,25 ℃,15 min下离心后取血清，分别标记为ua、ub、uc、ud、ue、uf。敌草快组家兔按预实验2 mL/kg量，分别给家兔a、b、c灌200 g/L敌草快溶液，按灌胃后1 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h及7 d分别从耳缘动脉取血3 mL，3000 r/min, 25 ℃,15 min离心后取血清，分别标记为1a、2a、3a、4a、5a、6a、7a，1b、2b、3b、4b、5b、6b、7b，1c、2c、3c、4c、5c、6c、7c。百草枯组家兔按2 mL/kg量分别给家兔d、e、f灌200 g/L百草枯溶液，按灌胃后1 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d分别从耳缘动脉取血3 mL，3000 r/min,25 ℃,15 min下离心后取血清1 mL，分别标记为1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d，1e、2e、3e、4e、5e、6e、7e，1f、2f、3f、4f、5f、6f、7f。向以上每管分别加0.4 g碳酸氢钠摇匀溶解后，加0.2 g连二亚硫酸钠摇匀，待1 min充分显色后即对比并拍照，20 min后再次观察颜色变化并拍照。

2 结果

2.1高效液相色谱法检测敌草快及百草枯浓度 在本实验色谱条件下,敌草快的最大吸收波长为309 nm,百草枯的最大吸收波长为258 nm ,分别选择309 nm与258 nm波长进行检测，2个峰的峰形良好，敌草诀标准曲线回归方程为Y=1.56×10-5X+0.585，r=0.9999；百草枯标准曲线回归方程为Y=1.08×10-5X-0.279，r=0.9999。20%敌草快溶液和20%百草枯溶液样品的色谱图分别为图1、2。20%敌草快溶液的浓度为7.34×104μg/mL，20%百草枯溶液的浓度为3.85×104μg/mL。

图1 高效液相色谱法检测20%敌草快溶液稀释10 000倍的色谱图

图2 高效液相色谱法检测20%百草枯溶液稀释10 000倍的色谱图

2.2体外实验 经碳酸氢钠-连二亚硫酸钠还原显色，健康人血清中加入敌草快溶液后显色为绿色，而加入百草枯溶液后显色为蓝色，并随溶液浓度的增加而颜色加深。敌草快溶液显色不稳定，20 min后显色变浅接近于正常对照组颜色，百草枯溶液显色较稳定，20 min后颜色未变，仍为蓝色(见图3、4)。

图3 不同浓度敌草快血清经碳酸氢钠-连二亚硫酸钠还原后1 min及20 min的颜色对比

2.3动物实验 制备敌草快中毒动物模型，家兔a血清经碳酸氢钠-连二亚硫酸钠还原后，中毒后1 h的血清呈绿色，而中毒6 h及更长时间后的血清颜色无明显变化，颜色与正常对照组接近(见图5)，家兔b、家兔c重复上述实验，结果相同。另一方面，制备百草枯中毒动物模型，百草枯中毒家兔血清经碳酸氢钠-连二亚硫酸钠还原后，中毒后1 h的血清呈蓝色，而中毒6 h及更长时间后的血清无明显变化，颜色与正常对照组接近(见图6)，家兔e、家兔f重复上述实验，结果相同。

图4 不同浓度百草枯血清经碳酸氢钠-连二亚硫酸钠还原后1 min及20 min的颜色对比

注：ub为正常对照管；1 b～7 b为不同时间点

注：ue为正常对照管；1 e～7 e为不同时间点

3 讨论

研究发现，百草枯进入机体后易被肺组织吸收且可在肺内大量聚集，由此产生的肺部损伤最为明显，虽然采用先进的生命支持手段及科学的设备可以降低百草枯中毒患者死于急性呼吸窘迫综合征和多器官功能障碍综合征的比例，但是仍不能阻挡百草枯中毒后急性肺损伤和肺纤维化的发生，以及降低百草枯中毒患者死于肺纤维化的比例[6]。作为百草枯的“孪生兄弟”敌草快，毒理作用与百草枯十分相似，但毒性明显低于百草枯。虽说目前无明确依据证实敌草快中毒后在肺内蓄积，出现类似百草枯中毒的快速肺纤维化，但肺脏依旧是敌草快中毒后损伤重要的靶器官之一。此外，成份标注为敌草快的商品中掺杂百草枯亦时有发生，由于目前敌草快及百草枯临床毒物检测尚未普及，临床中毒的诊断主要根据患者提供的病史。因此，如何快速有效地判断除草剂是敌草快还是百草枯已成为近几年共同关注的热点问题，对临床救治工作及判断预后具有重要意义。

目前，高效液相色谱法是检测敌草快和百草枯最常用的实验方法，具有灵敏度高、准确性好等特点，但价格昂贵，标本处理复杂，操作技术要求高[7]。而敌草快及百草枯中毒多发生在农村，基层医院医疗资源匮乏，因此应用受到一定程度的限制，无法在基层医院进行推广应用。为避免后续体外及动物实验中出现敌草快中毒伴随的百草枯中毒现象，本实验首先采用高效液相色谱法检测、鉴别购买的除草剂的种类是敌草快还是百草枯，结果得到可靠的色谱图用于后续研究。

由于高效液相色谱法难以在基层医院应用，因此，急需在基层医院开展快速、有效的毒物鉴别方法。碳酸氢钠-连二亚硫酸钠还原法具有操作简便、检验快速等特点，被临床上广泛应用于除草剂的鉴别，目前临床上多采用中毒患者尿液标本进行快速检测[8]。但尿液在体外容易被空气氧化而发生颜色变化，一定程度上影响了鉴别检测中利用颜色而进行观察，此外，有些患者中毒后很快就会出现无尿的症状，无法采集到尿液样本。本研究采用碳酸氢钠-连二亚硫酸钠还原法，通过体内及体外实验对敌草快和百草枯中毒后的血清进行鉴别检测。体外实验结果发现，经碳酸氢钠-连二亚硫酸钠还原显色，健康人血清中加入不同浓度的敌草快，1 min左右溶液显色为绿色，并随敌草快浓度增高颜色逐渐变深，20 min后绿色变浅，接近于正常对照组颜色。而健康人血清中加入不同浓度的百草枯，结果发现，溶液显色为蓝色，且随溶液浓度的增加而颜色加深，20 min后颜色仍为蓝色。为了解上述实验的时效性，本研究进一步采用灌胃的方式模拟临床敌草快及百草枯中毒，结果发现，中毒后1 h为碳酸氢钠-连二亚硫酸钠还原法鉴别敌草快及百草枯最敏感的时期，可以快速、有效地帮助医务人员，特别是院前急救人员及基层医务人员对除草剂敌草快及百草枯中毒进行早期鉴别。但中毒 6 h及更长时间后的血清颜色无明显变化，与正常对照组接近，这与高效液相色谱法检测的血药浓度代谢情况不甚相符，可能是敌草快在体内产生了代谢，降低了其浓度，也可能与本实验研究采用的敌草快剂量有关，其中的机制有待进一步研究。此外，本实验研究仍存在一定的挑战，如患者同时发生敌草快和百草枯中毒的情况，该方法在鉴别上存在困难，建议应用高效液相色谱法进行进一步鉴别。

综上所述，随着除草剂中毒发生率的增加，医务人员需要一种有效、便捷、快速的检测方法以鉴定、区分中毒毒物的种类，及时评估患者的中毒情况，进一步用于指导制定个体化的治疗方案与措施。采用碳酸氢钠-连二亚硫酸钠还原法能在敌草快和百草枯急性中毒血清中的鉴别，且在中毒后1 h内即可快速、有效地鉴别这两种除草剂，是一种具有广泛应用前景和便捷的检测方法，对基层医院具有十分重要的意义。