血小板活化水平与慢性阻塞性肺疾病急性发作相关肺动脉高压的临床研究

张书茵， 姜 俭， 邵荣海， 汤文夏， 李 响， 赵益明， 张宇航， 刘国涛， 朱静亚， 陆士奇

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种严重危害人类健康的常见病，其特征是持续存在的呼吸系统症状和气流受限[1]。我国40岁以上人群中COPD的患病率高达8.2%[2],严重影响患者的生命质量，给社会带来沉重的经济负担。随病情进行性发展，会引起肺动脉高压(pulmonary hypertension, PH),最终发展为肺源性心脏病[3]。因此，早期诊断及预防COPD相关PH成为该疾病研究的重点。

目前临床评估PH的方法中，胸部CT、超声等影像学检查手段因其便利、无创伤且操作性强逐渐在临床普及[4-5]。同时，部分血清学标志物也被研究证实与PH有密切联系。其中血小板活化导致的患者体内明显的高凝状态及肺小动脉内微血栓形成，是COPD患者病情进展并导致PH的主要原因之一，因此，血小板活化标志物CD61及CD62P受到关注[6-8]。

本研究拟通过心脏超声检查结果判断患者是否存在PH及病情严重程度,用流式细胞术检测CD62P/CD61双阳性(CD62P+/CD61+)血小板百分比及其平均荧光强度，用以了解血小板活化比例及活化程度，从而探索血小板活化水平与AECOPD患者PH病情及严重程度的相关性，并初步检验CD62P+/CD61+血小板百分比在临床评估COPD急性发作(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease, AECOPD)相关PH的可行性和应用潜力。

1 资料与方法

1.1研究对象 回顾性收集并分析2019年1月至2020年12月在太仓市第一人民医院住院诊断为AECOPD的患者共计122例,年龄49～93岁，平均年龄74.8岁。入组标准及排除标准均遵循STROBE规范[9]。入组标准：在24 h内入院并符合COPD急性发作诊断标准[1]，患者本人或家属同意参加本次研究。排除既往合并其他心血管疾病，存在其他呼吸系统疾病、特发性肺动脉高压、慢性血栓栓塞性肺动脉高压、结缔组织病、甲状腺功能亢进、人类免疫缺陷病毒感染、门脉高压及血吸虫病等的患者；排除患有痛风、血液系统疾病、恶性肿瘤，肝肾功能不全，脾切除，长期使用抗凝剂及抗血小板药物的患者；排除患者本人或家属未签署知情同意或不能配合行相关检查的患者。本研究得到太仓市第一人民医院伦理委员会批准[太仓科技局审批号：(2019)伦研批第(KY-2019-26)号]。

1.2研究方法

1.2.1 AECOPD及COPD相关PH定义 COPD诊断符合2017 GOLD慢性阻塞性肺疾病全球倡议[1]。急性加重期标准为患者具有明确COPD病史，就医时临床表现为咳嗽、咳痰加重，或咳出物为脓性痰液，呼吸困难，超出日常变异范围，或有发热、胸闷气喘及咳黄痰，或是需要改变平时的用药方案，病情较稳定期加重或需住院进行治疗,诊断为AECOPD。COPD相关PH患者诊断指标符合2009年欧洲心脏病学会PH诊断和治疗指南相关诊断标准[10-11]。根据心脏彩色多普勒超声检查结果计算肺动脉收缩压(PASP)，PASP≥36 mm Hg，且三尖瓣反流速度>2.8 m/s，在对其他引起PH的原因进行排除后，可拟诊断为COPD相关的PH。

1.2.2 相关临床资料收集 收集患者临床相关数据，包括一般情况、病史、入院24 h内心脏超声结果、入院24 h内血气分析数据、入院24 h血液学相关指标，检测CD62P+/CD61+血小板活化比例等。

1.2.3 超声心动图检查 由同一名医学影像专业技术人员对入组患者进行检查。使用GE Vivid E9彩色多普勒超声诊断仪，M5S探头，探头频率1.7～3.4 MHz。测量参数及测量方法符合之前文献报道[12-13]。

1.2.4 流式细胞检测CD62P+/CD61+血小板活化比例及膜蛋白表达荧光强度 抽取入组患者静脉血2 mL，激活血小板(ADP+全血)。在对照管中加入PE同型对照、CD61 PerCP各20 μL，在试验管中加入CD62-PE、CD61 PerCP各20 μL。在对照管和试验管中各加入未激活或激活的血标本5 μL并混匀，室温暗处孵育 15～20 min。各管中加入1 mL 冷的固定液(2～8 ℃)，充分混匀，2～8 ℃阴暗处放置30 min，24 h内上机分析。记录CD62P+/CD61+血小板百分比及荧光强度。

1.2.5 AECOPD患者分组 AECOPD患者根据入院24 h心脏超声结果计算PASP，分为单纯AECOPD组(n=45)及AECOPD合并PH组(n=77)[14]。按照PASP将入组患者分为无PH组(PASP<36 mm Hg,n=45)、轻度PH组(36 mm Hg≤PASP≤50 mm Hg，n=42)、中重度PH组(PASP>50 mm Hg,n=35)[12, 15]。

2 结果

2.1临床指标 单纯AECOPD组平均患病时间短，吸烟人数占比及吸烟支数明显低于合并PH组(P均<0.05)。AECOPD合并PH组血清学炎症指标明显高于单纯AECOPD组，主要表现为以下三个指标：血白细胞计数、C-反应蛋白(C-reaction protein，CRP)及白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)。见表1。

表1 单纯AECOPD与AECOPD合并PH患者一般情况

2.2心脏超声及血小板活化指标 合并PH组患者血小板百分比及CD62P+/CD61+荧光强度均明显高于单纯AECOPD组患者(P<0.01)。见表2。

表2 单纯AECOPD与AECOPD合并PH患者心脏超声及血小板活化指标

2.3AECOPD患者合并PH的独立影响因素 根据单因素Logistic回归分析得到,COPD患病时间(年)、吸烟与否、吸烟支数、WBC、CRP、IL-6、CD62P+/CD61+血小板百分比、荧光强度、RV内径、RA内径及TAPSE等11个指标是对AECOPD患者合并PH诊断具有意义的自变量。见表3。

表3 AECOPD合并PH影响因素的单因素回归分析结果

2.4多因素回归分析 以单因素分析结果为基础，结合临床实际，将吸烟与否、WBC、CRP、IL-6、CD62P+/CD61+血小板百分比、性别进行多因素Logistic回归分析，纳入标准为0.05，剔除标准为0.10，分析方法为进入。由多因素回归分析结果可知，对变量进行调整后，男性吸烟患者随IL-6升高，CD62P+/CD61+血小板百分比增加、CRP增加，AECOPD患者合并PH的可能性增加。该模型拟合优度P=0.984(Hosmer and Lemeshow检验)，能正确分类90.2%的研究对象。见表4。

表4 AECOPD合并PH影响因素的多因素回归分析结果

2.5CD62P+/CD61+血小板百分比联合血清学指标与AECOPD合并PH患者病情的相关性 IL-6的ROC曲线AUC为0.718，预测AECOPD患者合并PH的切点为29.6 pg/mL，敏感度为54.5%，特异度为80.0%。CRP的ROC曲线AUC为0.760，预测AECOPD患者合并PH的切点为47.5 mg/L，敏感度为59.7%，特异度为86.7%。CD62P+/CD61+血小板百分比ROC曲线的AUC为0.901，预测AECOPD患者合并PH的切点为11.6%，敏感度为70.0%，特异度86.7%。IL-6、CRP、IL-6及CD62P+/CD61+血小板百分比三者联合预测AUC为0.972，高于单一指标预测AECOPD患者合并PH的诊断能力。见图1。

图1 IL-6、CRP、CD62P+/CD61+血小板百分比预测AECOPD患者合并PH的ROC曲线

2.6CD62P+/CD61+血小板百分比与AECOPD合并PH患者严重程度的关系 随PASP增加，CD62P+/CD61+血小板百分比逐渐升高，Spearman线性相关系数为0.822，Pearson线性相关系数为0.719，P<0.01。中重度PH患者CD62P+/CD61+血小板百分比及相应荧光强度较轻度PH患者更高。中重度PH患者CD62P+/CD61+血小板百分比及相应荧光强度较无PH患者更高(P<0.05)。见图2、表5。

图2 PASP与CD62P+/CD61+血小板百分比的线性关系

表5 不同严重程度的AECOPD合并PH患者基本情况

3 讨论

PH是COPD患者主要的心血管并发症之一，并且是COPD病程进一步发展到肺源性心脏病的核心环节[16]。国内外研究[16-17]均显示，PH是COPD患者死亡及不良预后的独立危险因素之一。

COPD合并PH的发病机制复杂，一般认为，COPD所致的PH在组织病理学上的主要变化：低氧及炎症引起的肺小血管异常收缩，平滑肌细胞及内皮细胞增殖，血管内膜纤维化及管壁增厚，最终导致血流动力学紊乱，肺动脉压力增高。而早期评估、及时确诊、对症缓解是目前主要的临床措施。因此，更为及时方便的临床诊断指标对帮助临床医生判断患者病情并采取相应治疗手段有较大意义。

目前临床常用评估PH病情的影像学手段为多普勒超声心动图。研究[18]证实，超声检查与右心导管测量结果无明显差异，两者相关性良好。

本研究122例入组患者中，吸烟患者占76.2%，年平均吸烟数为588.9支，男性普遍吸烟比例高于女性，这一结果符合临床实际情况。本研究中患者的BMI较低，平均为21.8，推测是由于年龄偏大、纳差、长期低氧呼吸困难、反复感染及用药所致。这一结果与国外研究[19-20]结果一致。因此，正确劝导患者戒烟，并维持健康良好的生活方式有助于患者延缓病情进展。

本研究将患者分为单纯AECOPD组及AECOPD合并PH组，单纯AECOPD患者PASP为(30.4±5.3)mm Hg，而AECOPD合并PH患者的PASP为(51.2±12.6)mm Hg，差异有统计学意义(P<0.01)。PH发病率为63.1%，略高于文献[21]报道(35%～40%)，推测是由于本院收治的患者年龄较大，患病平均时间为15.9年，因此PH发生率较高。

对两组患者数据进行单因素及多因素Logistic回归分析，结果提示，男性、吸烟、IL-6、CRP和CD62P+/CD61+血小板百分比是AECOPD患者合并PH的独立危险因素。

血小板活化直接参与了PH形成的病理过程。AECOPD患者常合并感染、缺氧等并发症，会直接导致肺血管内膜损伤，导致血小板活化。活化的血小板黏附聚集于损伤处，形成附壁血栓，导致肺小动脉管腔堵塞，增加肺血管压力。另外，活化的血小板释放多种物质参与PH形成，具体如下：①释放血小板4因子，对抗组胺的抗凝血作用；②释放血栓素A2，直接促进血小板的聚集和二磷酸腺苷的释放；③血小板活化因子、二磷酸腺苷、5-羟色胺和凝血酶敏感蛋白促进血小板聚集，引起肺血管痉挛、收缩，促进肺血管平滑肌增殖；④释放血管内皮细胞生长因子、血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子和转化生长因子β等多种生长因子，刺激血管修复损伤及内皮细胞增生，同时刺激成纤维细胞和平滑肌细胞增生形成结缔组织，导致肺血管重构。CD62P是一种血小板活化特异性糖蛋白，表达于血小板内含的α颗粒膜、致密体颗粒膜及溶酶体颗粒膜表面，能够反映血小板活化状态[22-24]，是临床上判定血小板活化状态的“金标准”。

本研究结果提示，相关炎症因子也与PH的发生、发展具有密切联系。在COPD相关PH发病最初阶段，存在于肺动脉外膜的成纤维母细胞在长期缺氧暴露及肺动脉压力增加的刺激下被激活，导致了促炎因子的大量激活[25]。其中IL-6是COPD相关PH发病初期最重要的促炎因子之一[26]。IL-6 通过多个途径参与PH的形成：①IL-6为代表的炎性细胞因子聚集在肺血管内,刺激肺血管内皮细胞(PVEC)、人肺动脉平滑肌细胞(PASMC)迁移，导致血管重构发生[26]；②IL-6阻止了肌肉中的胰岛素信号传递，减弱了胰岛素诱导的肺动脉舒张功能，同时诱导弹力纤维层增生，肺血管管壁增厚,管腔狭窄[27]；③IL-6促进T淋巴细胞聚集，进一步刺激PVEC产生趋化因子,诱导PASMC迁移及增殖。

CRP是机体受到炎症性刺激时合成的一种急性时相蛋白。研究证明，CRP能够参与PH形成的病理生理过程，并且其含量与肺动脉压力呈正相关。其参与疾病病理生理的机制主要有：①CRP在PVEC表层发挥黏附分子效应，诱导单核细胞黏附，使之分泌更多的内皮素-1、血管性假血友病因子等，促使肺血管重构；②CRP激活核转录因子(NF)-κB信号通路，促进炎症反应，增加肺血管管壁厚度；③CRP促进PASMC增殖，增加PASMC的数量；④CRP诱导原癌基因低聚果糖基因的转录增加，上调多种基因的转录功能，从而促进肺血管细胞增殖及重构[28]。

众多研究[29]表明，炎症与凝血系统之间存在大量相互交叉关联的反应。炎症反应可通过多种途径直接或间接导致血小板活化，进一步加重炎症，促使PH的发生。首先，COPD患者长期反复的肺部炎症导致肺血管损伤，直接导致血小板活化；其次，血管内皮细胞损伤激活肺部环氧化酶及启动血小板内血栓烷合成酶，抑制前列环素(PGI2)合成酶，从而导致肺组织血栓素A2(TXA2)合成增多，PGI2合成减少，TXA2-PGI2平衡失调，导致血小板再聚集，促进血小板活化；再次，患者体内白细胞活化增多，同时激活血小板，并与活化的血小板结合形成血小板-白细胞聚集体(PLAs)，进一步促进PH形成；另外，IL-6可通过促进肿瘤坏死因子(TNF)-α释放，活化中性粒细胞，导致大量氧自由基释放，损伤血管内皮，激活外源性凝血系统，促使血小板活化。

综上所述，本研究结果提示，CD62P+/CD61+血小板活化百分比在临床评估AECOPD患者合并PH方面具有一定的应用价值及应用潜力。本研究具有一定局限性：采用心动超声结果作为本研究临床诊断PH的依据而非右心导管，此为受临床条件限制。右心导管检查为创伤性检查，且对技术要求高，在基层医院难以开展；同时患者对有创检查接受程度低。本研究为单中心队列研究，样本量相对不足，且研究人群局限于AECOPD患者人群，并未设置健康对照组进行对照验证。进一步的研究应增加样本量，设置健康人群对照组以进行更深层次的研究及探索。