血清miR-200c和氧化型低密度脂蛋白在急性脑梗死早期诊断和预后评估中的临床价值

李 翠， 洪丽萍

急性脑梗死(acute cerebral infarction, ACI)是常见脑血管病变，致残率高，预后差[1-2]。目前，临床多采用磁共振成像(MRI)、CT诊断ACI，但其对ACI早期的诊断价值并不高[3]。因此，寻找可早期诊断ACI、评估ACI患者预后的标志物，对早期诊治ACI、改善ACI患者预后甚是关键。研究认为，ACI病变过程除与动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)、炎症有关外，还与微小RNA(microRNA，miRNA)异常表达等有关[4-5]。已有研究发现，微小RNA-200c-3p(microRNA-200c-3p，miR-200c-3p)在缺血性脑卒中呈高表达，且其具有诊断缺血性脑卒中的潜在价值[6]。而秦慧兵等[7]发现，老年ACI患者氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoproteins, ox-LDL)水平较高，ox-LDL有望成为判定ACI患者病情、评估颈动脉粥样硬化程度的辅助指标。此外，朱伟军等[8]发现，miR-200c可调节ox-LDL诱导的人主动脉内皮细胞损伤。因此，推测miR-200c可能与ACI发病过程、预后及ox-LDL相关。基于此，本研究通过测定miR-200c在ACI患者血清中的表达水平，旨在分析其与ox-LDL、ACI患者预后的关系，及其早期诊断ACI的价值。

1 资料与方法

1.1临床资料

选取2017年11月至2020年12月本院诊治的167例ACI患者进行研究(ACI组)，男87例，女80例。并选取同期167例体检健康者进行对照研究(对照组)，男90例，女77例。另外，收集所有ACI患者吸烟、饮酒、收缩压、舒张压、冠心病史、糖尿病史、高血压史、美国国立卫生研究院卒中量表(national institutes of health stroke scale，NIHSS)评分、发病至治疗时间等资料。

纳入标准：①患者符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》[9]中有关ACI的诊断标准，经CT/MRI证实；②患者发病至入院<24 h，首次发病；③本研究经本院伦理委员会审核批准，患者自愿参与。排除标准：①合并急慢性感染、脑出血、自身免疫性疾病者；②服用抗炎药物者；③合并肝、肾、肺、心功能不全者；④近3个月内有手术、外伤史者。本研究经我院伦理会批准[批号：2017临审第(003)号]。

1.2方法

1.2.1 治疗方法及预后情况 入院后ACI患者进行常规心电监护，并纠正血压、血糖，抗凝、吸氧、抗血小板聚集、脱水等对症治疗。对ACI患者随访3个月，采用生活能力评分量表(modified rankin scale，MRS)评分评估其预后情况，以MRS评分≤2分为预后良好(预后良好组，122例)，以>2分为预后不良(预后不良组，45例)。

1.2.2 样本收集 收集ACI患者入院后治疗前及健康者体检当日空腹外周静脉血，静置26～30 min，分离血清(4800 r/min离心5 min)，分装，保存于-70 ℃冰箱。

1.2.3 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)法测定血清miR-200c表达水平 冰上解冻血清样本，以miRNeasy Serum/Plasma Kit(217184，德国Qiagen公司)抽提总RNA，且在抽提总RNA时加cel-miR-39作为内参对照，紫外分光光度计(NanoDrop One，美国Thermo Fisher Scientific公司)测定RNA浓度、纯度。之后以miScript Reverse Transcription Kit、miScript SYBR Green PCR Kit(218061、218076，德国Qiagen公司)合成cDNA并进行qRT-PCR扩增。qRT-PCR仪(Rotor-Gene Q，德国Qiagen公司)程序设定：97 ℃ 7 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共40个循环。cel-miR-39的引物序列：F为5′-CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3′，R为5′-CCAGTGCGT-GTCGTGGAGTC-3′；miR-200c的引物序列：F为5′-GTCTTACCCAGCAGTGT-3′，R为5′-GAACATGTCTGCGTATCTC-3′。以2-△△Ct法分析血清miR-200c相对表达量。

1.2.4 酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)测定血清ox-LDL水平 利用人ox-LDL ELISA试剂盒(JKSW70064，上海晶抗生物工程有限公司)配制ox-LDL的标准样品溶液，并解冻血清，以酶标仪(Chromate 4300，美国Awareness公司)测定ox-LDL标准品溶液、血清在450 nm处的吸光度，绘制ox-LDL的标准品回归曲线，结合ox-LDL的标准回归方程，计算血清ox-LDL水平。

2 结果

2.1ACI组、对照组血清miR-200c、ox-LDL水平比较 与对照组比较，ACI组患者血清miR-200c、ox-LDL水平均升高(P<0.05)。见表1。

表1 ACI组、对照组血清miR-200c、ox-LDL水平比较

2.2ACI患者血清miR-200c水平与ox-LDL的相关性 Pearson相关法分析显示，ACI患者血清miR-200c水平与ox-LDL呈正相关(r=0.544，P<0.05)。

2.3血清miR-200c、ox-LDL水平对ACI的早期诊断价值 ROC曲线显示，血清miR-200c早期诊断ACI的曲线下面积(area under curve，AUC)为0.867(95%CI0.826～0.907)，截断值为1.44，约登指数为0.658，敏感度、特异度分别为77.2%、88.6%；血清ox-LDL早期诊断ACI的AUC为0.850(95%CI0.807～0.893)，截断值为431.09 mg/L，约登指数为0.641，敏感度、特异度分别为74.3%、89.8%；两者联合早期诊断ACI的AUC为0.936(95%CI0.908～0.964)，约登指数为0.772，其敏感度、特异度分别为91.0%、86.2%。见图1。

注：ACI为急性脑梗死；miR-200c为微小RNA-200c；ox-LDL为氧化型低密度脂蛋白

2.4不同预后ACI患者的一般资料及血清miR-200c、ox-LDL水平比较 与预后良好组比较，预后不良组ACI患者年龄较大(P<0.05)，发病至治疗时间较长(P<0.05)，血清miR-200c、ox-LDL水平和NIHSS评分较高(P<0.05)，男/女比例、吸烟、饮酒、收缩压、舒张压、冠心病史、糖尿病史、高血压史比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同预后ACI患者的一般资料及血清miR-200c、ox-LDL水平比较

2.5Logistic回归分析ACI患者预后的影响因素 以ACI患者是否预后不良为因变量(是=1，否=0)，以上述P<0.05的指标和密切相关临床指标为自变量进行Logistic回归分析，结果显示，年龄、NIHSS评分、miR-200c、ox-LDL、发病至治疗时间是影响ACI患者预后的危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 ACI患者预后影响因素的Logistic回归分析

2.6血清miR-200c、ox-LDL水平对ACI患者预后的评估价值 ROC曲线显示，血清miR-200c评估ACI患者预后的AUC为0.874(95%CI0.810～0.938)，截断值为2.13，约登指数为0.649，敏感度、特异度分别为75.6%、89.3%；ox-LDL评估ACI患者预后的AUC为0.868(95%CI0.788～0.948)，截断值为582.06 mg/L，约登指数为0.671，敏感度、特异度分别为77.8%、89.3%；两者联合评估ACI患者预后的AUC为0.957(95%CI0.930～0.984)，约登指数为0.776，敏感度、特异度分别为95.6%、82.0%。见图2。

注：ACI为急性脑梗死；miR-200c为微小RNA-200c；ox-LDL为氧化型低密度脂蛋白

3 讨论

ACI是因脑血管闭塞，进而引发脑缺血缺氧造成脑损伤的一种疾病，可造成神经功能障碍，甚至引发死亡[10-11]。因此，寻找与ACI病理变化相关，且可早期诊断ACI、评估ACI患者预后的指标，对给予合适干预、改善ACI患者生存状况有积极意义。

miRNA可调控氧化应激、AS、炎症反应过程，与急性心肌梗死、ACI等密切相关[12-13]。研究发现，miR-200c作为miRNA成员之一，在胶质瘤中表达失调，miR-200c可能通过调节上皮间质转换过程进而影响胶质瘤病理过程，其可能是胶质瘤的治疗靶点[14]。另外，miR-200c在子痫前期中表达水平升高，其与子痫前期患者病变程度及妊娠结局相关，miR-200c可作为诊断子痫前期的潜在指标[15]。以上研究表明，miR-200c表达异常与血管异常类病变等有关。本研究中ACI患者血清miR-200c表达水平较高，且其早期诊断ACI的AUC为0.867，当血清miR-200c相对表达量>1.44时，ACI发生风险较大，提示miR-200c水平升高可能与ACI发生发展相关，且血清miR-200c水平可早期诊断ACI。推测miR-200c可能通过调节相关信号通路，影响血管炎症反应，进而在ACI中发挥作用，其具体机制有待深入研究证实。另外，本研究中预后不良的ACI患者血清miR-200c水平高于预后良好者，且其预测ACI患者预后的AUC为0.874，当血清miR-200c相对表达量>2.13时，ACI患者发生不良预后几率较高，提示miR-200c可能与ACI患者预后密切相关，且测定血清miR-200c水平有助于临床评估ACI患者预后情况。

ox-LDL是一种促炎蛋白，其可损伤内皮细胞，使其分解脂质的能力下降，导致多余脂质在内皮细胞上沉积，促使单核细胞向巨噬细胞转变，之后转变成泡沫细胞，引发AS；且ox-LDL可通过激活巨噬细胞等，促使机体产生大量炎性因子，激活炎症反应，诱发氧化应激反应，进而影响ACI病变过程[16-17]。研究发现，ox-LDL在ACI患者中呈高水平，经静脉溶栓治疗后，ox-LDL水平降低，其可能在ACI的氧化应激过程中起作用[18]。此外，蔡文灿等[19]研究发现，ACI患者血清ox-LDL水平较高，其有望成为评估ACI患者预后和疾病严重程度的辅助指标。本研究中ox-LDL在ACI患者血清中水平较高，与蔡文灿等[19]的研究一致，且预后不良的ACI患者血清ox-LDL水平高于预后良好者，提示ox-LDL与ACI病理发展及预后有关，推测ox-LDL可能通过破坏血管内皮细胞，促进脂质沉积、泡沫细胞形成，加快AS病理发展，或ox-LDL通过促使白细胞介素-2等炎性因子生存，触发炎症及氧化应激反应，从而影响ACI病变进程。此外，本研究中血清ox-LDL早期诊断ACI、评估ACI患者预后的AUC分别为0.850、0.868，与蔡文灿等[19]研究ox-LDL评估ACI患者预后的价值相近，血清ox-LDL>431.09 mg/L时ACI发生几率较高，血清ox-LDL>582.06 mg/L时ACI患者发生不良预后风险较大，提示ox-LDL可能对早期诊断ACI、评估ACI患者预后有一定临床价值，ox-LDL可作为早期诊断ACI、评估ACI患者预后的潜在指标。

既往研究显示，miR-200c在ox-LDL损伤的人主动脉内皮细胞中呈高表达[8]，故本研究探讨了ACI患者血清miR-200c与ox-LDL的相关性，结果显示，miR-200c与ox-LDL呈正相关，提示miR-200c、ox-LDL可能共同影响ACI病理变化，但具体机制需结合基础实验加以证实。本研究显示，血清miR-200c、ox-LDL水平及NIHSS评分升高，年龄较大，发病至治疗时间延长均会增加ACI患者发生不良预后几率，及时监控miR-200c、ox-LDL等指标有助于及时评估ACI患者预后情况。此外，本研究中血清miR-200c、ox-LDL联合早期诊断ACI的AUC为0.936，敏感度为91.0%，高于两者单独预测，同时特异度可达86.2%，而且miR-200c、ox-LDL联合评估ACI患者预后的AUC为0.957，敏感度为95.6%，特异度为82.0%，提示miR-200c、ox-LDL联合可提高对ACI早期诊断、ACI患者预后评估的价值，为临床早期诊断ACI、评估ACI患者预后提供可靠参考。

综上所述，miR-200c在ACI患者中呈高表达，与ox-LDL呈正相关，可作为早期诊断ACI、评估ACI患者预后的辅助指标，且其与ox-LDL联合可更有效地早期诊断、评估ACI患者预后。但本研究未深入探究miR-200c在ACI中的机制，且研究样本较少，后期需从多方面进行深入研究。