声学调控实体肿瘤理化微环境的机制与研究进展

冯玉仪 柳建华

华南理工大学附属第二医院,广州市第一人民医院超声医学科(广州 510180)

肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)是一个复杂的系统，在肿瘤的发展和进程中起着重要的作用，对肿瘤治疗效果有着显著的影响，针对TME治疗是目前的一个热点方向。TME由多种细胞(免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞、炎症细胞和淋巴细胞)、细胞外基质、血管系统、淋巴管系统等组成，肿瘤物理和化学微环境(tumor physicochemical microenvironment，TPCME)异常主要表现为高间质液压、缺氧、低pH等理化特性[1- 2]，是肿瘤对放化疗抵抗的重要原因，也是导致肿瘤进展和转移的主要因素之一[3]。由于肿瘤实质内TPCME的差异较大，因而对TME的全面了解有助于研发治疗癌症的新方法和策略，目前已有一些针对肿瘤物理微环境的各种成分的研究，例如低频非聚焦超声可以增加肿瘤血流灌注、降低肿瘤间质液压(tumor interstitial fluid pressure，TIFP)、增加药物穿透血管进入肿瘤实质等[4]。TPCME主要是有以下六个特点：(1)肿瘤血管畸形、形态和功能异常[5]。(2)肿瘤的淋巴管功能异常，淋巴回流受阻[6]。(3)实体肿瘤间质液压升高，影响药物和免疫细胞渗入肿瘤实质[7]。(4)细胞外基质异常，肿瘤相关成纤维细胞分泌大量胶原纤维，限制药物在肿瘤内扩散；成纤维细胞过度牵拉；纤维母细胞稀少或缺失，失去正常调节纤维伸缩的作用，透明质酸含量异常[8]。(5)缺氧，TME缺氧可改变正常微环境的功能，促进肿瘤进展，限制治疗效果；肿瘤内大多数区域的氧分压低于5 mmHg，而正常机体组织中氧分压大约为30～60 mmHg[9-10]。(6)pH值降低，肿瘤细胞的快速增殖以及肿瘤中不成熟和功能失调的血管的存在会降低氧转运的效率，导致肿瘤微环境缺氧状态(<10 mmHg)，使得糖酵解成为主要的供能方式，糖酵解产生的乳酸堆积在TME中，使得TME的pH呈酸性(6.3～6.5)[11]。

声学调控肿瘤微环境已有颇多研究，包括聚焦超声、低频非聚焦超声联合微泡、以及联合携氧微泡，可以改变肿瘤的血管、细胞外基质的结构，降低肿瘤的间质液压，改善肿瘤的缺氧等。

1 声学调控改善肿瘤内部结构

1.1 声学调控改变肿瘤血管结构

肿瘤的异常脉管系统导致微环境内的改变，其中血管的不充分灌注降低了肿瘤内的氧气和营养物质的可及性。与正常血管不同的是，实体肿瘤血管是畸形的、囊状的和混乱的[12]。在小鼠乳腺癌的血管中，肿瘤内皮细胞连接不良，相互重叠生长，并伸入血管腔。此外，在许多不同类型的实体瘤中，肿瘤血管壁有许多开口、细胞间连接变宽、基底膜覆盖不规则或不足。这些异常特征共同导致血管通透性高、弯曲和扩张，从而在整个肿瘤中产生不均匀的血流和有限的灌注。肿瘤血管形态出现异常，功能受损[13]。肿瘤边缘微血管密度高于肿瘤中心微血管密度。肿瘤血管形态缺陷导致肿瘤组织血流紊乱、组织缺氧[14]。肿瘤微血管的缺陷特征导致肿瘤容易生长和扩散，干扰放化疗的效果。TPCME中的缺氧诱导促血管生成分子的持续产生，如血管内皮生长因子和转化生长因子[15]。促血管生成因子和抗血管生成因子之间的不平衡导致快速但异常的肿瘤血管形成。通透性的增加导致了血管中蛋白质的渗漏，从而增加了TPCME中的间质胶体渗透压[7]。升高的TIFP会压迫血管，加剧缺氧状态，从而形成恶性循环，高TIFP限制了免疫细胞的浸润以及治疗药物的渗透。药物进入肿瘤组织主要依赖于其高通透性和强滞留效应，即EPR效应(enhanced permeability and retention,EPR)，这种效应取决于肿瘤血管系统的渗漏性质和药物的长时间循环，使得药物缓慢但不均匀地积聚在肿瘤上。影响EPR效应的因素：(1)肿瘤局部血流；(2)肿瘤血管通透性；(3)血管周围肿瘤细胞和细胞外基质的结构屏障；(4)TIFP[16]。

TPCME中的异常血管阻碍了肿瘤治疗的有效性，使肿瘤血管正常化策略可能增进治疗效果[17]，然而，治疗后肿瘤细胞增加其他促血管生成细胞因子的表达，补偿抑制作用，抗血管生成治疗(如抗血管内皮生长因子治疗)只能暂时逆转异常血管，这种短暂的血管正常化被称为“正常化窗口”，它在不同的肿瘤类型和肿瘤状态之间是不同的，在“正常化窗口”注入药物可提高抗肿瘤治疗效果[18]。

超声联合微泡的治疗是近年来超声治疗学的重要进展，该方法主要利用空化效应损伤肿瘤血管壁，从而调控肿瘤的微循环。研究显示：较低能量的超声联合微泡可增加肿瘤血管壁的通透性，开放血—组织屏障，以及增加微循环血流灌注，增加药物或基因的转运从而增强疗效[19]；较高能量的超声使肿瘤血管产生较严重的损伤，可明显降低、甚至阻断局部血流[20]。低频非聚焦超声联合微泡治疗通过空化效应改善血管的渗透性，空化效应对血管的作用是直接的、实时的，不需要筛选“正常化窗口”。微泡发生空化可在邻近的表面(如血管壁/细胞膜)上形成开口，增加粒子穿过自然屏障的渗透性，称为声孔效应。微泡的膨胀和收缩可以直接“推”和“拉”附近的表面，并在周围流体中诱导流体射流和微束[21]。Chen等[22]利用高速成像观察到空化效应的确切机制包括血管扩张、内陷和液体喷射，而且空化效应对血管的轻微损伤可以改善血管的通透性和药物的释放，大多数血管损伤经过一段时间后恢复。空化效应分为稳态空化(非惯性空化)和瞬态空化(惯性空化)。稳态空化包括气泡的重复收缩和膨胀，与超声波的交替压缩和稀疏循环同步，导致附近细胞的局部流体运动和剪切应力增强。瞬态空化指在较高的超声压力下，静脉内微泡的剧烈崩塌引起瞬时微射流，在血管壁上产生机械力，导致血管损伤甚至破裂[23]。

声压的选择是决定超声治疗效果的重要参数之一。低频非聚焦超声联合微泡治疗可损伤血管内皮细胞，使内皮细胞间隙增大，血管的通透性和红细胞向肿瘤间质的渗出增加。Wang 等[24]研究发现3.0 MPa和5.0 MPa治疗组治疗后即刻出现肿瘤微血管严重破坏，管状结构不可见，弥漫性出血。微血管损伤的程度在0.5 MPa和1.5 MPa治疗组较轻，表现为血管扩张、充血和出血。24 h后免疫组化发现，3.0 MPa和5.0 MPa使得肿瘤微血管密度显著降低。Xiao等[4]在研究中发现1.0 MPa超声联合微泡组肿瘤细胞局灶性坏死，微血管充血扩张，血管呈圆形或椭圆形，血管壁结构异常，红细胞渗漏，改善了肿瘤微环境，增强阿霉素的渗入。

高强度聚焦超声(high intensity focus ultrasound,HIFU)治疗是一种常用的非侵入性治疗方法，通过热效应或机械损伤杀死肿瘤细胞。HIFU对血管系统的破坏作用与微血管口径、血流速度和超声特征(发射率、强度和消融时间)有关[25]。Yang等[26]采用大鼠肝脏模型检测HIFU消融效应(4 MHz,550 W/cm2，4 s)。结果证实HIFU只能破坏200 μm范围内的肿瘤微血管。HIFU消融破坏肿瘤微循环，提高HIFU肿瘤治疗效果。使用兔腹主动脉模型检测HIFU治疗效果(4 MHZ，1 500 W/cm2，5 s)，实验证实HIFU对大血管安全，因为血管口径更大，血流速度更快。脉冲高强度聚焦超声(pulsed HIFU，pHIFU)利用分散在细胞中的微小气体作为空化核，当达到足够大的压力(即空化阈值)时，微小气体成长为气泡，因而pHIFU可产生持续且高强度空化效应。Van Leenders等[27]在pHIFU治疗后观察到瘤内出血严重，提示肿瘤内微血管破裂，阿霉素随着血管破裂渗入肿瘤内的量增多，HIFU治疗后不仅肿瘤组织发生凝固性坏死，肿瘤血管系统也会出现坏死。Guan等[28]应用HIFU治疗兔子宫内膜癌，发现HIFU消融组血管弹性蛋白板分解、弹性蛋白层排列混乱，彻底破坏肿瘤的微循环和含有弹性蛋白的大血管。

微泡还可作为化疗药物、基因等的载体，将化疗药物装载或结合到直径小于红细胞直径的微泡上，并可在体外发射超声，使得微泡发生空化效应，空化效应产生的爆破力可使其承载的药物穿过毛细血管壁进入瘤内[29]。这使得进入瘤内的药物比单独注射微泡+药物的方式有所增多，但并未明显减轻对正常组织的毒副作用。

1.2 声学调控细胞外基质结构

细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是由胶原、蛋白多糖/糖胺聚糖、弹性蛋白、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等多种糖蛋白组成的非细胞三维大分子网络，基质成分和细胞粘附受体相互结合，形成一个复杂的网络。细胞表面受体将信号从ECM传递到细胞中，ECM调节多种细胞功能，如生存、生长、迁移和分化，对维持正常的细胞功能至关重要[30]。

肿瘤力学改变是许多实体癌的一个特征，反映在间质压力和压缩负荷的增加、ECM的硬化以及细胞收缩性和流变性的增强，有助于肿瘤的侵袭，并影响治疗效果。

已有多种方法通过重塑ECM来改善肿瘤治疗效果，针对ECM胶原成分的治疗策略可分为：(1)抑制胶原合成；(2)基质胶原降解；(3)抑制胶原交联，阻断胶原相互作用。针对透明质酸治疗方法也可分为三类：(1)透明质酸降解；(2)抑制透明质酸合成；(3)阻断透明质酸信号传导[31]。声学调控在细胞外基质方面应用较少，Zhang等[32]研究表明低频非聚焦超声治疗后(1.0、3.0、5.0 MPa)，兔VX2移植瘤的细胞外基质的胶原纤维结构及数量未见明显变化。Li等[33]研究发现pHIFU治疗后，使用高倍镜可发现胶原纤维明显受损，表现为方向性丧失和密集胶原束分离，胶原纤维有磨损的迹象，间质基质的破坏使KPC小鼠胰腺肿瘤中化疗药物阿霉素的浓度增加了4.5倍。体外研究发现治疗性低强度超声可增加包裹的小鼠成纤维细胞(3T3)的胶原和糖胺多糖生成，以及增加人类成纤维细胞的细胞数量，但这一结果仅限于体外，截至目前，仍没有研究证实在体内治疗性的低频非聚焦超声可以改变ECM的结构及成分[34]。

2 声学调控肿瘤微环境理化特性

声学调控可改变肿瘤结构，肿瘤微环境的各个理化特性以及免疫微环境亦会随之而改变。

2.1 声学调控降低IFP，增进治疗效果

TIFP升高被认为是治疗实体肿瘤的一大障碍，阻碍了药物进入肿瘤组织间隙。TIFP升高引起各种药物在肿瘤内的异质性分布，促进肿瘤内缺氧，导致放化疗抵抗。实体瘤中TIFP的增加是多因素导致的[7]。TIFP包括液体应力和固体应力，液体压力包括毛细管的压力和间质的压力，两者都可以进一步细分为静水压力和胶体渗透压。肿瘤内部的非流体元素产生固体应力，包括生长诱导的应力和外部施加的应力。生长诱导的应力是间质中增殖的肿瘤细胞和基质细胞之间的相互作用所施加的压力。外部施加的应力是生长中的肿瘤与其周围正常组织之间的相互作用所产生的压力[35]。

正常组织内间质液压大约为-1～-3 mmHg，而实体肿瘤TIFP均升高，通常在10～40 mmHg，例如：乳腺癌约30 mmHg，子宫颈癌、转移性黑色素瘤TIFP均大于20 mmHg。TIFP升高的原因尚不明确，主要有几下几点：(1)肿瘤血管系统异常；(2)缺乏功能性淋巴系统，淋巴回流受阻；(3)细胞外基质异常：成纤维细胞缺失以及透明质酸含量增多[36- 37]。目前已有一些药物和方法可降低TIFP，如针对血管的贝伐单抗(血管内皮生长因子拮抗剂)，针对细胞外基质胶原纤维的胶原酶以及针对透明质酸的透明质酸酶，可增进治疗效果[38- 39]。降低TIFP还有一系列的物理方法，如放疗、高温热疗、低频非聚焦超声、HIFU、光动力、声动力疗法等。

声学调控TIFP主要有以下两种情况：(1)低频非聚焦超声联合微泡治疗可以降低TIFP，其机制可能是空化效应改变了血管的通透性，超声空化还可以栓塞肿瘤血管，减少肿瘤血液供应，以此减少TIFP。此外，惯性空化还可以导致内皮细胞凋亡，间接降低TIFP[40]。Xi等[41]发现通过低频非聚焦超声联合微泡产生的空化作用可以降低TIFP，增加兔VX2肿瘤中声敏剂的积累，提高声动力的治疗效果。(2)HIFU也可以通过机械效应和热效应使肿瘤细胞发生坏死的凋亡以及瘤内血管坏损，从而使得TIFP降低[42]。Sassaroli等[43]认为使用HIFU治疗后肌肉快速发生肿胀，这种肿胀可能是由于HIFU暴露过程中一些关键连接蛋白的损伤导致IFP的最初下降。

肿瘤细胞外基质结构和成分异常也是TIFP升高的主要因素，通过胶原蛋白酶降解胶原蛋白、血小板衍生生长因子抑制胶原信号传导，地塞米松抑制胶原生成均可以达到降低TIFP的作用，但低频非聚焦超声在体内对ECM胶原纤维的数量和结构并无显著影响，HIFU治疗后胶原纤维明显受损，表现为方向性丧失和密集胶原束分离，此外还有胶原纤维磨损的迹象[33]。

2.2 声学调控可改善肿瘤内部缺氧环境

实体肿瘤细胞的增殖异常快速，而肿瘤血管生长不足，且存在结构和功能异常，导致肿瘤内部血流的空间和时间异质性。

实体瘤通常包含急性或慢性缺氧的区域，不同区域缺氧程度不同，缺氧对于肿瘤的发生发展是把双刃剑。一方面，微环境缺氧使癌细胞生长和增殖受到抑制，缺氧被认为是通过降低细胞分裂能力来限制肿瘤生长的一个因素[44]。但另一方面，多项研究发现，降低氧张力使得恶性程度高、适应能力强的细胞存活下来，并诱导多种细胞适应，再次维持和促进癌症进展，从而诱导癌症生长。缺氧可通过诱导血管生成、增加糖酵解改变代谢和上调参与细胞存活/凋亡的基因来改善氧合和生存能力[45]。

缺氧细胞也被认为对大多数抗癌药物具有耐药性，原因有：(1)缺氧细胞远离血管，因此没有充分暴露于某些类型的抗癌药物中；(2)细胞增殖随着离血管的距离而减少；(3)缺氧细胞对p53介导的凋亡失去敏感性，这可能降低对某些抗癌药物的敏感性；(4)某些抗癌药物(例如博莱霉素)的作用类似于放疗。因此，缺氧在肿瘤预后中具有关键的负面作用，因为它会导致对标准治疗的抵抗，并促进更恶性的表型[46]。

目前，放化疗仍然是治疗恶性肿瘤的主要手段，肿瘤实质中的氧浓度对肿瘤放疗和化疗的效果有着很大的影响，对于一些乏氧的肿瘤，放化疗的效果十分有限，如胰腺癌[47]。临床实验表明，高压氧治疗增加了组织中的氧张力，提高放射治疗的效率[48]。Hatfield等[49]研究发现呼吸60%高浓度氧可以改善肿瘤内部缺氧情况，并且使得肿瘤内部免疫抑制状态转化为免疫激活状态，这可能是由于肿瘤内部缺氧情况改善，使得抑制T细胞作用的腺苷生成减少，使原本在缺氧状态下被抑制的T细胞激活，在呼吸高氧24小时后肿瘤出现消退迹象。

声学调控肿瘤缺氧微环境有以下几种方法。Ho等[50]把氧气包裹在微泡里面，通过超声外照射使得携氧微泡中的氧气在瘤内释放，通过携氧微泡治疗后，肿瘤缺氧诱导因子HIF-1α表达减少。McEwan等[51]证明了载氧微泡超声治疗中改善了药物的细胞毒性。杨希等[52]发现，在不同超声强度条件下辐照脂氟显微泡，局部化疗后肿瘤组织中HIF-1α表达水平均降低。

2.3 肿瘤微环境pH值降低

肿瘤微环境pH值降低与肿瘤微环境缺氧密切相关。在生理、灌流良好的条件下，保持相对稳定，接近血液，正常组织的间质pH值通常在7.3到7.4之间[53]。正常细胞的细胞内pH值略为碱性，约为7.1，细胞外pH值更为碱性，约为7.35。差异似乎很小，但pH值是H+(质子)浓度的对数表达式，因此，pH值相差0.25意味着质子浓度相差很大[54]。

酸性的肿瘤微环境与缺氧微环境类似，可以产生具有更多恶性表型的癌细胞群。在基因型没有改变的情况下，对环境胁迫(如缺氧和酸中毒)的适应可以改变蛋白质的表达模式，从而促进细胞能力的获得，例如导致治疗抵抗。在此条件下，最适合生存的癌细胞或进化成最适合生存的癌细胞扩展为优势癌细胞群。因此，通过改变肿瘤微环境中的酸化程度，将癌细胞可侵袭性和治疗抵抗力降至最低[55]。

考虑到肿瘤微环境在细胞间相互作用方面的复杂性以及曲折的细胞外空间的扩散障碍，在模拟实体癌组织的几何形状和结构组成的实验制剂中，需要对酸碱调节及其后果进行研究。

基于肿瘤内的酸性微环境，学者们设计了pH响应性的药物、光敏剂、纳米平台，使得这些药物可以靶向发挥作用，而对pH正常的组织无作用[56- 57]。张丽等[58]构建一种能在酸性环境下高效释药的双配体pH敏感阿霉素前药-微泡复合物，超声辐照可使复合物分散均匀、粒径减小，有助于药物进入肿瘤组织并在肿瘤酸性环境中释放，提高其体内抗肿瘤能力。pH调节在癌症治疗中的研究仍处于起步阶段，这一领域还有很多工作要做。声学调控肿瘤微环境缺氧的同时，肿瘤微环境中的pH也会随着变化，这一方面还有待验证[58]。

3 展望

TPCME中各组分之间相互影响，互为因果。如血管系统的异常加重了缺氧，而缺氧又导致血管内皮生长因子分泌增多，促使形成更多异常的血管。声学调控肿瘤微环境各个组分已经在药物递送系统上研究颇多。通过空化效应引起细胞膜产生声孔效应来提高基因转染效率亦是当前较为热门的研究之一。通过超声联合微泡作用于TPCME不仅改变了其结构及理化特性，同时也改变了其免疫微环境等。通过声学调控改变肿瘤微环境中这些异常的因素，达到治疗肿瘤乃至增强肿瘤的治疗效果值得深入研究。目前，免疫检查点抑制剂(PD-1、PD-L1、CTLA- 4)、嵌合肿瘤抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)是当前肿瘤免疫的研究热点。尽管CAR-T已经在血液肿瘤治疗方面取得了巨大成功，但是在实体瘤的应用上面举步维艰，很大一部分原因在于实体肿瘤特殊的微环境使得CAR-T细胞难以进入肿瘤组织内发挥作用。能否以声学调控改善肿瘤微环境增加CAR-T细胞等免疫细胞的浸润，需要我们进一步验证。