蒙古马盲肠中纤维素分解菌的筛选、鉴定及酶学特性分析

■李雅静 宋海燕 苏少锋，3 其日格日 陶金山 张建强 芒 来 赵一萍*

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古自治区马属动物遗传育种与繁殖重点实验室，农业农村部马属动物遗传育种与繁殖科学观测实验站，内蒙古农业大学马属动物研究中心，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010010；3.内蒙古自治区农牧业科学院生物技术研究中心，内蒙古 呼和浩特 010031；4.兴安职业技术学院，内蒙古 乌兰浩特 137400）

蒙古马以放牧为主，长期生活在草原上，在饲喂方式上以干草为营养来源，具有耐粗饲料的优良特点，能适应极粗放的饲养管理，这种食草特性与其肠道中纤维素分解菌有着密切的联系。马为非反刍单胃动物，它有特殊且较发达的胃肠道，肠道中后肠系统（结肠和盲肠）是食物消化吸收的主要场所，可通过微生物发酵降解植物纤维。蒙古马盲肠有“发酵罐”之称，是微生物发酵的主要部位，其内寄生着大量可以分解纤维素的微生物菌群，这也是蒙古马相较于其他物种耐粗饲性的重要原因。1999年，Julliand等[1]的研究发现，在马盲肠菌群中纤维素分解菌占有主导地位，其内存在有22%的蛋白水解菌和78%的纤维素分解菌，且盲肠中的纤维素分解菌的比例远大于后肠末端，是末端结肠的6 倍[2]。在自然界和动物体内存在着大量的纤维素分解菌，这些微生物在动物饲养、微生态制剂和资源利用等方面有着广阔的应用前景。因此，筛选和优化出酶活力较高的纤维素分解菌是解决纤维素资源利用的有效途径。已有研究从土壤、海洋等环境以及多种动物消化道中成功分离和筛选出纤维素分解菌[3-9]，但从马属动物体内分离和筛选纤维素分解菌的研究极少。本试验以蒙古马盲肠内容物为试验材料，旨在筛选、分离出高效的蒙古马源纤维素分解菌株，为马源纤维素分解菌和纤维素酶的工业生产和利用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验动物来源于内蒙古自治区锡林郭勒草原自由采食的5 匹蒙古马，年龄在3～5 岁，其中公马3 匹，母马2匹；由于春季禁牧，放牧季节为夏季到冬季；草地上常见牧草种类有大针茅、羊草、冰草、糙隐子草、苔草、冷蒿。蒙古马在屠宰后剖开腹腔，迅速分离盲肠，取内容物50 mL于无酶无菌的离心管中密封，置入冰盒，迅速带回实验室开始纤维素分解菌的分离与筛选，每匹蒙古马所取内容物为独立样品进行处理。

1.2 方法

1.2.1 纤维素分解菌的分离、筛选

取蒙古马盲肠内容物1.0 g 放入无菌培养瓶中，加入无菌生理盐水至100 mL。在80 ℃恒温水浴锅中振荡30 min后，取菌悬液按照10-2～10-6进行梯度稀释，取各浓度稀释样本100 μL 均匀涂布于羧甲基纤维素钠（CMC-Na）固体培养基平板上[10]。37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，采用刚果红染色法筛选菌株。最后通过菌落周围形成的降解圈直径（D）与菌落直径（d）比值为筛选细菌降解纤维素能力的一个初步标准。而后将比值（D/d）大的菌落进行纯化和培养。将初筛选出的D/d 值大的菌株菌液浓度OD600nm值调到1.0左右，按1%接种量接种于LB液体培养基，在37 ℃、220 r/min 条件下发酵培养24 h，重复2次。离心后收集上清液作为确定纤维素酶活力检测的粗酶液。

1.2.2 纤维素酶活力测定

纤维素酶活力的测定依据我国农业行业颁布的标准（NY/T 912—2004）为参考。采用3，5-二硝基水杨酸试剂法测定纤维素酶活力[11]。每组试验做3次平行。

1.2.3 纤维素分解菌的鉴定

1.2.3.1 形态学鉴定

取培养3～5 d 的纯化菌液进行革兰氏染色，确定细菌的革兰氏属性。并观察细菌在CMC-Na 平板上的生长状况，包括菌落形状、形态、透明度、颜色和边缘整齐程度等。

1.2.3.2 生理生化特性鉴定

按照API 50 CHB 和API Staph 试剂盒说明书，测定的指标有D-葡萄糖、淀粉、甲基-α-D-吡喃甘露糖苷和柠檬酸铁等。

1.2.3.3 纤维素分解菌分子学鉴定

提取菌株基因组DNA，采用通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和反向引物1492R（5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）进行细菌16S rDNA 的扩增[12]。PCR 扩增的反应体系包括：2×Tap PCRMaster Mix 12.5 μL、细菌基因组DNA（50～100 ng/μL）2.0 μL、上下游引物（10 pmol/L）各1 μL、无离子水8.5 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环；72 ℃修复延伸10 min。反应结束后，取产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像系统观察结果。菌株测序所得16S rDNA序列通过NCBI中BLAST软件进行同源性分析，再用Mega 4.1 软件构建系统发育树。

1.2.4 酶学特性的研究

1.2.4.1 最适pH和最适温度

使用不同pH（4.0～7.0）的缓冲液分别稀释粗酶液和溶解1.0% CMC-Na，在40 ℃、30 min 的反应条件下，测定酶活力以确定最适pH。同时，用粗酶液与不同pH（3.0～10.0）等比例混合测定CMC 酶液的相对酶活力。在确定最适pH 反应条件下，将菌液与1.0%CMC-Na 溶液混合，在不同温度（40～80 ℃，每5 ℃为一变量）的水浴中反应30 min，根据测得的酶活力确定最适反应温度。

1.2.4.2 纤维素分解菌在不同发酵条件下的产酶特性

在同样接种量和条件下，改变之前培养基中碳源，以秸秆粉、玉米粉、微晶纤维素、苜蓿粉4 种物质为碳源，其余组成成分不变，研究不同种类的碳源对Bacillus amyloliquefaciensH3 产酶方面的影响。在确定碳源后，选择2%和1.5%蛋白胨和酵母粉混合物、1%酵母粉、1%蛋白胨、1%尿素为氮源，发酵后取发酵液测定纤维素酶活力，确定最佳氮源。

2 结果与分析

2.1 纤维素分解菌的分离及筛选

采用CMC-Na 固体培养基初筛，从蒙古马盲肠内分离的多株菌的菌落周围都产生了清晰的透明圈，经划线纯化培养、刚果红染色，确定其中D/d比值大的10株菌进入复筛。再以10株菌在摇瓶发酵28 h的羧甲基纤维素酶（CMCase）活力为依据（见表1），最终确定将编号为H3、D/d 值为4.0（降解圈直径为12 mm、菌落直径为3 mm）、CMCase活力为0.60 U/mL的纤维素分解菌用于后续试验（见图1）。

表1 分离筛选纤维素分解菌株

图1 菌株H3的降解圈

2.2 菌株H3形态学鉴定

形态学鉴定结果表明，菌株H3颜色呈灰白色，不透明，周围呈皱醭状，表面较平滑。对菌株进行革兰氏染色，呈现为阳性，在显微镜下观察发现杆状的菌体，菌体两边钝圆，具有芽孢（见图2）。

图2 菌株H3的形态和革兰氏染色

2.3 生理生化特性鉴定

菌株H3 的生理生化特性经比对和分析，可将其初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），鉴定结果见表2。

表2 菌株H3的生理生化检测结果

2.4 菌株分子学鉴定

将菌株H3 DNA通过1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，所得电泳条带单一（见图3）。利用细菌通用引物进行PCR 扩增，以H3 菌株基因组DNA 为模板，1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测后，得到了1 500 bp的目的条带，大小与预期结果基本一致（见图4）。经测定，证明纤维素分解菌H3的有效基因片大小为1 515 bp。

图3 菌株H3 DNA的电泳图

图4 菌株H3 16S rDNA PCR扩增产物

2.5 纤维素分解菌系统进化树的构建

利用BLAST 软件对菌株H3 16S rDNA 基因序列进行分析，发现该菌序列与芽孢杆菌属的相似性高达99%，通过利用Mega 4.1构建系统发育进化树进行同源性分析，发现H3与Bacillus amyloliquefaciens亲缘关系最接近（见图5）。综合该菌株的形态学、生理生化特性以及分子鉴定结果，最终确定试验筛选出的纤维素分解菌H3 为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的一种或变种，将其命名为Bacillus amyloliquefaciensH3。

图5 菌株H3的系统发育树

2.6 Bacillus amyloliquefaciens H3 分泌纤维素酶的酶学特性

2.6.1 不同pH 对菌株Bacillus amyloliquefaciensH3产CMCase的影响

pH 可影响酶的催化效率，Bacillus amyloliquefaciensH3 反应的最适pH 为4.8；在pH 3.0～4.8 时，CMCase 随着pH 升高而逐渐升高；当pH 4.8～7.0 时，CMCase 随着pH 升高而降低（见图6）。CMCase 在pH 3.0～8.0 范围内的缓冲液中30 ℃、1 h 酶活力相对稳定，保持在70%～92%，具有较强的耐酸碱性；pH 9～10时，相对纤维素酶活力降到40%（见图7）。

图6 pH对酶活力的影响

图7 pH对酶稳定性的影响

2.6.2 不同温度对菌株Bacillus amyloliquefaciensH3产CMCase的影响

在确定适合的pH 条件基础上，纤维素酶发生反应的最适温度为65 ℃，其酶活力最高为0.60 U/mL（见图8）。在不同的温度下，菌液与底物反应1 h后，当温度为40～50 ℃时，该酶相对活力在80%左右，稳定性强；当温度为50～80 ℃时，酶活性迅速下降（见图9）。

图8 温度对酶活力的影响

图9 温度对酶稳定性的影响

2.6.3Bacillus amyloliquefaciensH3在不同碳源、氮源条件下的产酶特性（见图10）

Bacillus amyloliquefaciensH3可以利用秸秆粉、玉米粉、微晶纤维素、苜蓿粉4种碳源，其中以微晶纤维素作为碳源时产酶量最少，而以玉米粉作为碳源时，产酶量最多，可达1.10 U/mL。在以蛋白胨和酵母粉混合物、1%酵母粉、1%蛋白胨和1%尿素为氮源时，确定以2%蛋白胨和酵母粉混合物作为氮源时，产酶量最高，可达1.20 U/mL，其余氮源产酶量依次为1.5%蛋白胨和酵母粉混合物、1%酵母粉、1%蛋白胨、1%尿素（见图10）。

图10 不同碳、氮源对酶活力的影响

3 讨论

纤维素是一种大分子多糖，占植物碳含量50%以上[13]，是微生物重要的碳源之一。作为自然界中广泛存在、价格低廉的一种可再生型能源，如何充分利用纤维素能源，对缓解资源危机、环境污染和饲料能源紧缺具有重大的研究意义。而微生物能够对结构复杂的纤维素进行有效降解，因此利用微生物技术是实现纤维素资源能源化、肥料化的一种有效途径，也在提高动物采食量和饲料利用率、改善饲用品质等方面具有显著作用[14]。

目前该技术被广泛应用于众多草食性动物胃肠道内容物或粪便的筛选中，如猪[15]、牛[16]、双峰驼[17]和大熊猫[18]等。但是从蒙古马肠道中分离分解纤维素细菌的研究鲜见，而蒙古马耐粗饲料的优良特点与其肠道微生物群落组成及多样性息息相关。本研究以蒙古马盲肠内容物为试验材料，分离筛选具有高效降解纤维的解淀粉芽孢杆菌，可为发酵工业生产纤维素酶提供菌种来源与试验依据。

本试验采用以CMC-Na为唯一碳源的培养基，使用刚果红染色法初步分离筛选纤维素分解菌[19]，以纤维素被酶作用后形成的透明水解圈与菌落直径的比值为依据，初步确定其中D/d 值大的10 株菌进入复筛。而后进一步确认菌株的产酶活力，最后选定蒙古马盲肠内纤维素分解菌优势菌株H3（D/d 值为4.8，CMCase 活力为0.60 U/mL）。本试验菌株H3 通过形态学鉴定、标准生理和生化特性鉴定和16S rDNA 序列比对分析发现，H3 与芽孢杆菌属的同源性高达99%，与Bacillus amyloliquefaciens遗传距离关系最近。

刘海艳[20]从藏香猪粪便中分离筛出了芽孢杆菌属，利用BHM 培养基培养和纯化后，其酶活力可达0.92 U/mL；杨伟平等[21]从鹅粪便中鉴定出纤维素降解活力较强的芽孢杆菌属，其酶活力为0.83 U/mL；Sadhu 等[22]从大象的粪便中分离并筛选出一株芽孢杆菌属，其酶活力为0.37 U/mL。本试验筛选出的Bacillus amyloliquefaciensH3 的酶活力（0.60 U/mL）略低于刘海艳等[20]和杨伟平等[21]获得的芽孢杆菌，高于Sadhu等[22]分离筛选出的芽孢杆菌。

解淀粉芽孢杆菌自然界分布十分广泛，在土壤、堆肥、动物体内和植物表面、青贮玉米秸秆饲料，甚至污水、湖泊的底泥中均可发现并分离得到，它是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，可合成各类纤维素酶，具有促进纤维素资源分解与利用的潜在能力。菌种来源、发酵培养条件，如pH、温度、碳源、氮源等因素均可影响纤维素分解菌酶活力[23]，通过分析不同条件Bacillus amyloliquefaciensH3 的酶学特性，可进一步优化和提高纤维素酶活力。通过调整培养基配方及其比例，从而改变解淀粉芽孢杆菌生长活力，也可以导致产纤维素酶的能力有所改变。pH和温度是影响微生物生长的化学和物理因素，可对微生物产生的酶活力和稳定性有着一定的作用。从耐受能力看，Bacillus amyloliquefaciensH3具有较强的酸碱耐受力，这与王卉等[24]报道的解淀粉芽孢杆菌对酸碱的稳定性基本一致；戴秀华等[25]报道的解淀粉芽孢杆菌最适温度为26 ℃，到52 ℃时菌体几乎全部死亡。本试验分离菌株最适温度为65 ℃，在温度为40～50 ℃时，该酶活力稳定性强，高于戴秀华的文献报道。纤维素分解菌在发挥降解或发酵作用时，含氮源、碳源的物质是多样的，因而研究不同的氮源、碳源对纤维素分解菌酶活力有着一定的影响，尤其在家畜饲喂中对饲料种类的选择和配比有着深远的意义。本试验对不同氮源研究发现，Bacillus amyloliquefaciensH3 以2%蛋白胨和酵母粉混合物作为来源时酶活力最高；对碳源的利用中，以玉米粉酶活力最高，玉米粉作为最有价值的碳源，其成本低廉、来源丰富。试验也进一步验证Bacillus amyloliquefaciensH3 酶活力与碳源的结构有关系，随着碳源的粗糙程度升高，其酶活力降低。

4 结论

本研究从蒙古马盲肠中筛选并鉴定出一株可有效降解纤维素的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensH3，它具有相对较高的纤维素酶活力。该菌株所产生的纤维素酶具有一定的耐酸碱性和热稳定性，有较好的开发潜力。为进一步优化纤维素分解菌酶活力提供科学的参考依据，为马源纤维素分解菌和纤维素酶的后续工业生产和利用提供基础。