炮制对硫熏白芍饮片检控指标的影响

丁 妍，孔 铭，徐亚运，李松林

0 引 言

硫磺熏蒸是中药材常用加工方法，然而，过度硫熏会导致药材SO2等有害残留物增加[1-2]，主要活性成分转化，生成含硫衍生物[3-5]，药效降低，存在安全隐患[6-7]。因此国内外以SO2残留量为检控指标用于控制硫熏药材质量，其中现版《中国药典》规定白芍等10味中药材及其饮片SO2残留量不得超过400 mg/kg[8]。白芍为毛茛科植物芍药(PaeonialactifloraPal1.)的干燥根，临床常用大宗药材，也是传统采用硫熏加工的药材。白芍的有效成分主要为芍药苷、羟基芍药苷、芍药内酯苷等，统称为白芍总苷(TGP)，其作为联合用药和辅助用药，可增强其他药物的疗效[9]。中药饮片是临床方剂和中成药的重要原料，其质量直接影响中医临床疗效。饮片经过不同炮制加工过程，不论外观性状还是内在品质、药性与药材相比均发生了明显变化。前期研究发现《中国药典》SO2残留测定方法在测定硫熏白芍药材时存在假阴性和限量不客观的不足[10]，而白芍硫熏特征衍生物的限量检查可作为硫熏白芍药材检控的有效补充[11-13]，但硫熏特征衍生物结合SO2残留能否作为硫熏白芍饮片的检控指标有待深入研究加以科学评估。本研究选择《中国药典》收载的白芍饮片法定品种炒白芍、酒白芍为研究对象，考察不同炮制方法对硫熏饮片SO2残留量、硫熏特征标志物及主要活性成分含量的影响，为硫熏白芍饮片检控指标的选择提供科学数据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料Waters 2695高效液相色谱仪(美国Waters)；Waters 2996紫外检测器(美国Waters)；METTLER 万分之一及百万分之一电子天平(瑞士梅特勒公司)；KQ-250E型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Millipore Milli-Q 超纯水制备仪(美国Millipore公司)。

对照品没食子酸(购自中国食品药品检定研究院，批号110831-201605，纯度>98%)；磺酸化芍药苷自制，纯度>98 %；芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸(成都普菲德生物科技股份有限公司，批号分别为140518、PS000826、140807，纯度均>98%)；五没食子酰葡萄糖(四川省维克奇生物科技有限公司，批号为140611，纯度>98%)；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

生白芍饮片(批号150921)购自亳州市万珍中药饮片公司，经李松林研究员鉴定为毛莨科植物芍药PaeoniaLactifloraPall.干燥根的切制干燥饮片。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备①硫熏白芍饮片制备：取未硫熏白芍饮片400 g，加水40 mL，放置在自制硫熏装置中，硫磺用量10 g/h，熏制2 h，取出，于50 ℃鼓风干燥后，室外晾晒15 d，即为硫熏白芍饮片[12]。②炒白芍和炒硫熏白芍饮片制备：取未硫熏白芍饮片和自制硫熏白芍饮片200 g，置炒制容器内，文火炒制18 min，至断面呈微黄色，偶有焦斑为止[14]，各平行制备2份。③酒白芍和酒硫熏白芍饮片制备：取未硫熏白芍饮片和自制硫熏白芍饮片200 g，置于托盘容器内，加入黄酒20 g，然后平铺开来，密闭2 h。取出，放于炒至容器内，用文火炒制23 min，断面呈黄色，偶有焦斑，有酒香气[14]，即得酒炙硫熏白芍饮片样品，平行制备2份。

1.2.2 硫熏特征衍生物和活性成分的含量测定采用HPLC法测定硫熏特征衍生物及芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸、五没食子酰葡萄糖、苯甲酸5种活性成分含量。

色谱条件：根据文献报道确定色谱条件[11]，Altima C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱(0～20 min，5%→10%A；20～40 min，10%→20%A；40～90 min，20%→30% A)；流速1.0 mL/min；检测波长230 nm；柱温35 ℃；进样体积20 μL。

混合对照品溶液的制备：精密称取没食子酸、磺酸化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸、五没食子酰葡萄糖对照品适量，加甲醇制备成0.061、0.176、0.152、1.133、0.012、0.099 mg/mL的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：取白芍饮片粉末0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇溶液50 mL，超声提取(250 W，50 kHz)30 min，用50%乙醇补足溶液，静置，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜过滤上清液[11]，即得炒白芍、炒硫熏白芍、酒白芍和酒硫熏白芍供试品溶液。

1.2.3 SO2残留量测定采用《中国药典》2015年版(四部)“二氧化硫残留量测定法(酸碱滴定法)”测定硫熏白芍饮片[14]，炒硫熏白芍饮片及酒硫熏白芍饮片的SO2残留量。

2 结 果

2.1 HPLC法测定硫熏特征衍生物和活性成分的含量HPLC色谱图见图1。硫熏特征衍生物及芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸、五没食子酰葡萄糖、苯甲酸5种活性成分测定结果显示，炒硫熏白芍中芍药苷含量略低于炒白芍，分别为28.00 mg/g和30.18 mg/g。白芍饮片硫熏后活性成分转化，产生磺酸化芍药苷，含量为3.93 mg/g，而经炒制和酒炙后，磺酸化芍药苷含量分别为3.99 mg/g、3.92 mg/g，含量未见明显变化。见图2。

1:没食子酸; 2:磺酸化芍药苷; 3:芍药内酯苷; 4:芍药苷; 5:苯甲酸; 6:五没食子酰葡萄糖

图2 不同白芍饮片中硫熏特征衍生物和活性成分的含量

2.2 SO2残留量测定法测定白芍不同炮制品中SO2含量结果硫熏白芍饮片、炒硫熏白芍饮片及酒硫熏白芍饮片的SO2残留量测定结果显示，白芍饮片经硫熏后SO2残留显著增加，本实验中白芍饮片熏蒸2 h后，SO2残留量达861.08 mg/kg，远远超过了《中国药典》规定的400 mg/kg的限量标准，应判为不合格白芍饮片。然而经炒制后，SO2残留量明显降低，测得量为323.59 mg/kg，降低了62.42%，按《中国药典》炒白芍的SO2残留量限量要求，则属于合格饮片。同样，硫熏白芍酒炙后，SO2残留残留量为364.46 mg/kg，降低了57.67%，也可判断为合格饮片。见图3。

图3 硫熏白芍饮片SO2残留量

3 讨 论

3.1 炮制对硫熏白芍饮片SO2残留量的影响本研究表明，炮制可降低硫熏白芍SO2残留量，但不能完全去除SO2残留，不合格的硫熏饮片经炮制后可使SO2残留达到饮片标准。因此，SO2残留无法体现饮片实际的硫熏程度，单一的SO2检控指标对硫熏饮片的检控可能存在不足。

3.2 炮制对硫熏白芍饮片含硫衍生物的影响白芍饮片硫熏后活性成分转化，产生磺酸化芍药苷，而经炒制和酒炙后，含量未见明显变化，表明炮制过程对硫熏白芍特征衍生物影响较小。研究显示白芍药材中磺酸化芍药苷的含量与硫熏程度呈正相关[13]，是白芍药材硫熏程度的真实反映。因此，我们认为磺酸化芍药苷同样真实反映了白芍饮片的硫熏程度，可作为白芍饮片的硫熏检控指标。

3.3 炮制对硫熏白芍饮片整体质量的影响未硫熏白芍饮片炒制后，芍药苷和五没食子酰葡萄糖含量稍有下降，苯甲酸含量升高，化合物总量降低；而酒炙后，没食子酸、氧化芍药苷，芍药苷和五没食子酰葡萄糖含量则均有所增加，化合物总量增加。炒硫熏白芍相比于炒白芍，化合物总量增加，化学成分组成及比例明显改变；酒硫熏白芍相比于酒白芍，与炒硫熏白芍相比于炒白芍含量变化趋势相同。硫熏白芍饮片炮制前后与未硫熏白芍饮片炮制前后含量变化趋势相同，炒制后化合物总量略有下降，而酒炙后化合物总量略有升高，但差异无统计学意义。总之，白芍炮制前后化合物整体质量变化较小，硫熏导致的化学成分转化是导致饮片质量改变的主要因素。

3.4 硫熏白芍饮片安全性检控指标评估研究发现白芍硫熏后化学成分改变，且已在硫熏白芍中发现6个含硫衍生物[15]，同时硫熏导致白芍活性和体内吸收代谢改变，存在肾毒性的隐患[16]，需加强对硫熏白芍的质量控制。当前单一的SO2残留指标在检控硫熏白芍药材存在不足。综合本研究结果发现，炮制可降低饮片SO2残留量，但磺酸化芍药苷受炮制影响较小。单一SO2残留指标不能客观体现硫熏白芍饮片内在质量变化，磺酸化芍药苷可直接反映硫熏白芍饮片内在质量，因此，SO2残留量结合磺酸化芍药苷可以作为硫熏白芍饮片的安全性检控指标。