陆地棉GhPKE1的生物信息学分析及功能验证

王琴琴， 陈修贵， 陆许可， 王帅， 张悦新，范亚朋， 陈全家， 叶武威*

（1.新疆农业大学农学院，教育部棉花工程研究中心，乌鲁木齐 830052；2.中国农业科学院棉花研究所，棉花生物学国家重点实验室，河南 安阳 455000）

土壤盐渍化和重金属毒性已成为作物可持续生产的主要威胁［1］。在众多农作物中，棉花是开发和利用盐渍化土地的理想作物之一［2］，也是适合种植在工业污染地区的作物之一［3］，但是棉花中与重金属胁迫相关基因的研究较少。

Fe、Cu、Zn、Co、Mn、Mo、Ni是植物生长所必需的微量元素，过量则具有毒性；而一些重金属元素，如Ag+、Cd2+、Pb2+、Hg2+等，即使在低剂量下也具有高度毒性［4-5］。重金属不仅对植物生长具有显著影响，而且对土壤微生物群落的结构和功能也具有显著影响［6］。重金属相关结构域（heavy metal-associated domain，HMAD）在植物重金属响应中起着重要作用。植物和微生物对重金属胁迫响应的信号网络主要包括钙信号通路、激素信号网络、丝裂原活化蛋白激酶信号（mitogenactivated protein kinase，MAPK）和过氧化物信号网络，其中以离子解毒和转运为主［7-8］。金属螯合物在离子解毒和转运过程中起重要作用［7-8］，其主要包括植物螯合素（phytochelatin synthase，PCs）和金属硫蛋白（metallothioneins，MTs），MTs通过清除活性氧和螯合作用保护植物免受重金属的侵害，甚至对冷、热、盐、干旱等非生物胁迫抗性也具有重要作用［9-10］。与金属螯合物相比，重金属离子转运家族包括p型ATP酶和阳离子转运载体，例如，重金属腺苷三磷酸酶（heavy metal association，HMA）、ABC膜转运蛋白、自然抗性相关巨噬细胞蛋 白（naturalresistance-associated macrophage protein，NRAMP）、阳离子扩散促进子家族蛋白（cation diffusion facilitator family，CDF）、黄色条纹转运蛋白（yellow stripe-like YSL transporter）、锌铁调控蛋白（ZRT，IRT-like protein，ZIP）、阳离子交换剂（cation-exchanger，CAX）、铜转运蛋白（copper transporter，CTR）、多向耐药性蛋白（pleiotropic drug resistance，PDR）、金 属 响 应 转 录 因 子（metallic responsive transcription factors，MTF-1）［11-12］。对于重金属腺苷三磷酸酶超富集因子，液泡区隔化和重金属离子长距离易位依赖于p型离子泵（ATPases）和一组液泡质体转运蛋白在重金属稳态中发挥重要作用［13］。

Li等［14］从 野 生 番 茄（Solanum pennellii，LA0716）中分离到一个富含脯氨酸、赖氨酸和谷氨酸的基因SpPKE1，研究表明，PKE1具有脯氨酸、赖氨酸和谷氨酸的某些特征，而富含脯氨酸和富含赖氨酸的蛋白在非生物胁迫中发挥重要作用［15-16］，由此推测PKE1可能参与植物的非生物胁迫响应［14］。因此，本研究从陆地棉中9835克隆了GhPKE1，对其展开生物信息学分析，并进一步构建pYL156：GhPKE1沉默载体，对其在棉花中的功能进行验证，为进一步研究棉花的抗逆机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 种质材料 以陆地棉中9835为供试材料，由中国农业科学院棉花研究所抗逆鉴定实验室提供。

1.1.2 菌种和质粒 大肠杆菌（E.coli）DH5α和农杆菌（LB4404、GV3101）均购于上海唯地生物技术有限公司，pYL156、pYL192（辅助载体）和阳性对照PDS（phytoene desaturase）、pBI121载体等均由中国农业科学院棉花研究所抗逆鉴定实验室提供。

1.1.3 主要试剂和引物 棉花总RNA提取试剂盒购于北京天根生化科技有限公司；用于基因克隆和定量分析的反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司；基因克隆高保真酶、基因克隆试剂盒、普通PCR酶均购自诺维赞生物公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购于上海创赛科技有限公司；限制性内切酶购于NEB有限公司；质粒提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；所用CaCl2、亚精胺、MS盐、培养基、卡那霉素、利福平等实验用品均购于北京Solarbio有限公司；其他常规试剂都为国产分析纯。引物合成和基因测序均由上海生工生物工程有限公司完成。

1.1.4 仪器设备 试验仪器主要包括人工培养箱、PCR仪、电泳仪、全自动凝胶成像系统、Nanodrop2000、水浴锅、纯水/超纯水仪、制冰机、白光紫外照胶仪、超净工作台、紫外分光光度仪、恒温摇床、−20/−80℃低温冰箱、常温离心机、冷冻离心机、Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪、高压灭菌锅、烘箱、移液枪等。

1.2 试验方法

1.2.1 试验材料处理方法 将中9835种子进行浓硫酸脱绒后。挑选颗粒饱满的种子，依次用20%～30%双氧水浸泡3 h消毒灭菌，再用蒸馏水反复清洗6次（每次1 min），最后用无菌水浸种催芽12 h。将露白的种子播种于灭过菌的沙土，在人工培养箱培育至三叶期移到300 mmol·L−1Na2SO4溶液中胁迫处理12 h，分别取棉花的根、茎和叶组织各3份，同时取其第2片真叶放入液氮中速冻，置于−80℃保存备用。

1.2.2 试验菌液准备 分别将试验用到的4种菌液（pYL156：GhPKE1、pYL156、pYL192和PDS）活化12h，进行扩摇，培养基为高温灭菌的液体LB培养基（50℃，加卡那霉素和利福平），摇床中培养（28℃，黑暗培养），培养时长为16h左右，OD值（600 nm）达到1.5左右，5 580 r·min−1离心20 min，收集菌体。加入等体积已配制好的无菌重悬液（MES 10 mmol·L−1，AS 200 µmol·L−1，MgCl210 mmol·L−1，pH 5.6）震荡，重悬菌体，保证没有菌块存在，将菌液室温避光静置4 h，准备侵染。

1.2.3 qRT-PCR 实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）采用TransStart Top Green qPCR SuperMix荧光定量试剂盒。每个反应包含100 ng cDNA，上下游引物各0.4µL，SuperMix 10µL，加水至20µL。扩增程序：95℃ 5 min；95℃ 15 s，58℃20 s，72℃30 s，40个循环。3个生物学重复，3个技术重复，内参基因为GhHistone3。

1.2.4GhPKE1的克隆 用Premier 5软件设计GhPKE1引物（表1），以cDNA为模板进行扩增，PCR扩增程序：95℃ 3 min；95℃ 15 s，56℃ 15 s，72℃ 50 s，35个循环；72℃ 5 min；4℃保存。PCR产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测后回收和纯化。采用一步克隆法将连接载体进行线性化处理后与PCR纯化产物混合，将纯化后的PCR产物连接至pBI121载体。然后将一步克隆产物转入E.coliDH5α，试验步骤参照试剂盒使用说明书。最后进行蓝白斑筛选挑取阳性克隆进行测序，获取正确的克隆载体GhPKE1-t，置于−20℃保存。

表1 GhPKE1的引物序列Table 1 Primer sequence of GhPKE1

1.2.5 构建pYL156：GhPKE1的VIGS载体 选择KpnⅠ和BamHⅠ作为pYL156的酶切位点，获得线性pYL156载体，双酶切线性化载体反应体系总体积 30 µL：10×Tango Buffer 5 µL、载体质粒pYL156 10µL、KpnⅠ 1µL、BamHⅠ 1µL、ddH2O 13µL。37℃水浴过夜。采用一步克隆法，将线性化处理后的载体与PCR纯化产物混合构建pYL156：GhPKE1载体，一步克隆反应体系总体积10µL，包含双酶切线性化载体pYL156 3 µL、5×CE Ⅱ Buffer 2µL、PCR纯化产物 4µL、ExnaseⅡ1µL。37℃水浴30 min。然后将一步克隆产物转入E.coliDH5α，转化步骤按照 pEASY-Blunt Clonging Kit使用说明书。最后进行蓝白斑筛选挑取阳性克隆，于LB液体培养基（含50 mg·L−1卡那 霉 素）200 r·min−1、37 ℃ 培 养 6 h，再 用V-GhPKE1上下游引物进行PCR扩增验证后，将阳性菌液送至生工生物工程股份有限公司进行测序。对测序结果正确的菌液用TianGen的HiPure BAC DNA小量提取试剂盒提取质粒转入农杆菌。

1.3 VIGS侵染棉花及目的基因表达量检测

采用1.2.1的方法育苗，待中9835植株两片子叶平展时，用一次性的医用5 mL注射器吸取事先准备好的菌液，在叶片背面进行注射，当菌液面积达叶片总面积85%时停止注射。然后将植株置于25℃黑暗培养24 h后，在适宜的温度（光照26℃16 h；黑暗24℃8 h）下继续培养以保证幼苗正常生长。当注射了PDS（PDS转化植株叶片变白，说明试验系统构建成功）的植株叶片出现白化后，再对VIGS侵染植株和未侵染植株分别进行Na2SO4和CdCl2胁迫处理，当VIGS侵染的植株出现变化时，采用1.2.1的取样方法进行取样，通过qRT-PCR测定GhPKE1的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 GhPKE1蛋白的理化性质

GhPKE1基因全长1 048 bp，编码区753 bp，该基因存在2个内含子。通过ExPASY网站（https://web.expasy.org/protparam/）的 ProtParam 程序对GhPKE1编码的蛋白进行分析，该基因编码蛋白质分子式为C1224H1939N321O369S15，共计3 868个原子，相对分子质量27.54 kD，等电点9.3；编码250个氨基酸，其中50个带正电的氨基酸（Arg+Lys），37个带负电的氨基酸（Asp+Glu），不稳定系数为35.56，脂肪系数为41.84，总平均亲水性为−1.114；预测该蛋白为碱性蛋白，不含有吡咯赖氨酸、硒半胱氨酸和组氨酸，色氨酸含量最低，为0.4%，赖氨酸含量最高，为18.0%，其次是脯氨酸12.8%和谷氨酸11.6%。

2.2 GhPKE1蛋白质的亲水性//疏水性

利用ProtScale网站（https://web.expasy.org/protscale/）对GhPKE1蛋白的亲疏水性进行预测，结果（图1）表明，亲水性总平均值为−1.60，其中85位的K，88位和151位的D，98位、108位、119位、129位、139位的E，亲水性最强，分值均为−3.256；48位的T疏水性最强，分值为2.222。整体来看，该蛋白中亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，因此该蛋白为亲水性蛋白，具有一定的亲水能力。

图1 GhPKE1蛋白的疏水性/亲水性Fig.1 Hydrophilicity/hydrophilicity analysis of GhPKE1protein

2.3 GhPKE1蛋白的亚细胞定位与跨膜分析

通 过 WOLF PSORT 网站（https：//wolfpsort.hgc.jp/）对GhPKE1蛋白亚细胞定位进行预测，该蛋白在植物细胞细胞核的可能性最大。通过TMHMM网 站（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对GhPKE1蛋白的跨膜结构域进行分析（图2A）表明，该蛋白不存在跨膜结构域，属于非跨膜蛋白，与其疏水性区域分析结果相一致。利用SignalP-4.0网站对GhPKE1蛋白的信号肽进行预测（图2B），结果表明，C值（剪切位点）为0.118，S值（信号肽）为0.171，Y值（综合剪切点）为0.131。综上所述，GhPKE1蛋白不是分泌型蛋白，不能在细胞中发生迁移。

图2 GhPKE1蛋白的跨膜结构域分析和信号肽预测Fig.2 Prediction of transmembrane domain and signal peptide in GhPKE1 protein

2.4 GhPKE1蛋白的二级结构分析

通过SOPMA网站（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？ page=npsa_sopma.html）对GhPKE1蛋白的二级结构进行预测，结果（图3A）表明，无规则卷曲包含135个氨基酸，占54.00%；α螺旋包含48个氨基酸，占19.20%；β-转角包含19个氨基酸，占7.60%；延伸链包含48个氨基酸，占19.20%。通过GlobPlot 2.3网站（http：//globplot.embl.de/）对 GhPKE1蛋白序列中的紊乱区、球蛋白区进行预测，结果（图3B）显示，该蛋白存在3个不稳定区，分别位于78～95、123～139和184～247氨基酸位置，在1～77位处形成一个较大的潜在球形蛋白区。以上结果与在PSIPRED 网站（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）预测的GhPKE1蛋白二级结构（图3C）相一致。

图3 GhPKE1生物信息学分析Fig.3 GhPKE1 bioinformatics analysis

2.5 GhPKE1蛋白的互作网络分析

通 过 InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）网 站 和 STRING 网 站（https：//string-db.org）对PKE1蛋白互作网络预测分析发现（图3D），含有HMAD功能结构域的GhPKE1蛋白（IPR006121）与拟南芥中AT4G16380相似度高达69.8%，与10个蛋白之间存在互作。

2.6 GhPKE1蛋白的作用位点分析

通过NetPhos3.1 Server网站（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）对 GhPKE1 蛋白进行磷酸化位点分析（图4A），发现有15个位点磷酸化；结合 PROSITE（https：//prosite.expasy.org/）分析表明，GhPKE1中LYS_RICH结构域（18～154 aa）中含有1个磷酸化位点。对所预测的15个磷酸化位点进一步地分析鉴定（图4B），推测GhPKE1蛋白有4个重要位点，分别是56～63位的酪氨酸激酶磷酸化位点（tyrosine kinase phosphorylation site）、68～70位的蛋白激酶C磷酸化位点（protein kinase C phosphorylation site）、183～186位的酪蛋白激酶2磷酸化位点（Casein kinaseⅡphosphorylation site）和C端247～250位的 Prenyl group结合位点（CAAX box）。

2.7 VIGS侵染后棉花的表型和GhPKE1的表达量分析

根据生物信息学分析结果，针对GhPKE1的N端设计VIGS引物，以没有进行VIGS侵染的棉苗作为对照（CK），当侵染了PDS植株在三叶期叶片出现白化后，再对 CK、pYL156和 pYL156：GhPKE1侵染的植株分别进行Na2SO4和CdCl2胁迫处理。用 300 mmol·L−1的 Na2SO4处理 12 h 后（图5A），pYL156：GhPKE1侵染植株茎秆弯曲、真叶明显萎蔫，而CK和pYL156侵染植株仅真叶轻微萎蔫。用 20 mmol·L−1的 CdCl2溶液处理 VIGS植株12 h后（图5B），与CK和pYL156侵染植株相比，pYL156：GhPKE1侵染植株的真叶变为褐色且严重萎蔫，子叶枯萎凋落，茎部变为褐色。检测VIGS侵染植株中GhPKE1的相对表达量，结果（图5C和5D）表明，用pYL156：GhPKE1侵染过的植株中GhPKE1转录水平与CK组相比，叶片中表达量显著降低。

图5 VIGS侵染后的棉花表型及GhPKE1基因相对表达量Fig.5 Cotton phenotype and the relative expression level of GhPKE1 after VIGS infection

3 讨论

含有HMAD的基因一方面可以选择性地吸收和运输金属离子［17］，另一方面与逆境胁迫存在交叉作用［18］。首先，液泡不仅作为Na+区隔化［19］，也可以作为重金属区隔化，其中重金属腺苷三磷酸酶起到重要作用［18，20］。重金属腺苷三磷酸酶属于1b型离子泵，也称为CPx离子泵，负责离子解毒/转运［21-22］和液泡区隔［23］。在双突变体中，重金属腺苷三磷酸酶不仅影响重金属的转运［24］，还影响植物的生长发育［25］。盐胁迫与重金属毒性在一定程度上存在重叠，多种综合的因素和化学信号参与了胁迫相关反应［26］。通过序列相似性搜索，本研究发现棉花中含有HMAD功能结构域的基因GhPKE1，其富含赖氨酸（18.0%）、脯氨酸（12.8%）和谷氨酸（11.6%），该基因的编码蛋白稳定且具有一定的亲水能力。GhPKE1蛋白不是分泌型蛋白，不具有跨膜结构域，在细胞中不发生迁移，二级结构以无规则卷曲和α螺旋为主。定位于细胞核的GhPKE1蛋白有4个重要的磷酸化位点，与其他蛋白间存在互作，这些生物信息学分析为GhPKE1蛋白的VIGS片段选择和未来的分子机制研究奠定了基础。

有研究显示，番茄中MYB或MYC转录因子可以直接调控PKE1，从而抵抗非生物胁迫［14］。PKE1在叶片中存在高甲基化，但在生殖器官中不存在，表明PKE1不仅在幼苗时期发挥作用，在生殖阶段也具有耐盐性［14］。PKE1可以与F-box蛋白结合［27］，表明PKE1在转录后水平对耐盐基因起调控作用［14］。在番茄中过表达SpPKE1能增强转基因植株的耐盐性［14］，在烟草中过表达SpPKE1能增强植株的耐旱性［27］。本研究在棉花植株中沉默GhPKE1基因，发现沉默后植株中GhPKE1转录水平较CK显著降低；盐或重金属胁迫后，植株更容易枯萎死亡，抗逆性显著降低。因此，推测GhPKE1基因不仅与耐CdCl2相关，而且也与耐Na2SO4相关，它们之间存在交叉作用，但该基因的具体功能还需要进一步研究。