假喜马拉雅块菌化学成分分析及其抗氧化能力研究

李新爱，郭文秀，张烨，张旭，尹胜，王欣宇，郭大乐*，邓赟*

1(成都中医药大学 药学院，四川 成都，611137)2(会东高川天源农业科技有限公司，四川 凉山彝族自治州，615000)

块菌，又称松露，隶属Tuber属块菌科Tuberaceae，是一类著名的菌根型野生食药用菌，研究表明块菌含有丰富的营养物质及生物活性物质，主要含有17种氨基酸、8种维生素、以及多糖、蛋白质、雄性酮、甾醇、多酚、鞘脂、脂肪酸、微量元素等。具有增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤、益胃、清神、止血、疗痔等多种生物活性，是药物的潜在替代品[1]。研究发现块菌中具有活性的多糖和次生代谢产物(多酚、甾醇及黄酮类成分)，能抑制或减缓其他分子氧化，能够有效清除DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、羟自由基等自由基，具有较好的抗氧化能力。人体进行代谢时，自由基在线粒体内产生，多余的自由基可以被抗氧化剂清除进而维持其在体内的代谢平衡。但是，一些外部因素，如吸烟、环境污染、工业溶剂、臭氧、一些药品和农药等，可促进自由基的产生，打破体内平衡，进而引发机体衰老以及癌症、动脉粥样硬化、肺气肿等疾病[2-3]。因此，天然氧化剂的发现，有助于延缓人的衰老，降低这些疾病出现的概率。

据估计，块菌属在全球有180种之多，我国目前已报道有60余种。目前关于块菌研究，多集中于物种多样性、生态学、遗传学、人工栽培等方面，化学成分方面多聚焦于多糖及其挥发性成分，至今尚无其系统化学成分分析的研究，且多集中于印度块菌，会东块菌等[1]。基于此，本实验采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法(ultra-performance liquid chromatography- tandem q-exactive quadrupole-electrostatic field track trap high resolution mass spectrometry，UPLC-Q-Orbitrap HRMS)借助Compound Discoverer 3.0软件，根据化合物的精确相对分子质量、色谱保留时间、特征离子碎片信息，并结合数据库和相关文献比对，对假喜马拉雅块菌的营养成分进行鉴定，根据化合物的质谱信息，结合对照品、数据库及文献信息对假喜马拉雅块菌中的化学成分进行鉴定，以期为其药效物质基础、质量评价及物种鉴定方面提供参考，通过对其抗氧化能力进行研究，为资源的有效利用提供帮助。充分挖掘块菌的食药用价值，把块菌中的有效成分应用于食品、药品、保健品及化妆品中，进一步推进块菌产业发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 药材

假喜马拉雅块菌于2020年12月采集于四川省攀之花市会东县(20200806)，将其进行测序，根据形态特征和18S rRNA基因序列比对，鉴定为T.pesudohimalayense。该菌种现保存于成都中医药大学药学院生化制药实验室。

1.1.2 试剂

苯丙氨酸、亮氨酸、L-酪氨酸对照品，中国食品药品检定研究院；L-谷氨酸对照品，成都市科隆化学品有限公司；腺苷，英国PureChemLand公司；苯甲酸、油酰胺、没食子酸对照品(对照品纯度均>98%)，成都克洛玛生物科技有限公司；碳酸钠、水杨酸钠、硫酸亚铁、过氧化氢、铁氰化钾、三氯乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化铁、碳酸钠，北京化工厂；福林酚试剂，北京索莱宝试剂公司；水为娃哈哈纯净水；乙腈、甲醇(色谱纯)，成都科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

Vanquish型超高效液相色谱联用Q-Exactive型四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪、Varioskan LUX多功能酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；SL302 N万分之一电子天平，上海民侨精密科学仪器有限公司；QE-50型高速粉碎机，浙江屹立工贸有限公司；SCIENTZ-10 N冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；超声波清洗机，成都雅源科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析

1.3.1.1 供试品溶液

将新鲜假喜马拉雅块菌，冷冻干燥，将冻干的假喜马拉雅块菌粉碎，称取适量本品粉末(过二号筛)约1 g，精密称定，置50 mL锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，称定质量，浸泡1 h，超声处理(150 W，40 kHz)30 min，放冷，称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液[4-6]，备用。

1.3.1.2 对照品溶液

取苯丙氨酸、亮氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸、腺苷、苯甲酸、油酰胺、吡嗪对照品适量，加甲醇超声使溶解并定容至25 mL，配制成质量浓度约0.05 g/L的混合对照品，溶液置于4 ℃冰箱中保存，使用时过0.22 μm 微孔滤膜。

1.3.1.3 检测条件

(1)色谱条件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流动相0.1%乙酸水溶液(A相)-乙腈(B相)梯度洗脱:(0～4 min，5% B；4～7 min，5%～10% B；7～10 min，10%～16% B；10～20 min，16～32% B；20～24 min，32%～60% B；24～30 min，60% B；30～36 min，60%～70% B；36～43 min，70%～95% B；43～46 min， 95% B，流速0.3 mL/min，进样量3 μL，柱温30 ℃。

(2)质谱条件

离子源：采用电喷雾离子源(ESI)，扫描方式：正、负离子监测模式，正负离子源电压：3 500～3 000 V，质量扫描范围：m/z100～1 500；裂解电压：(ESI+)3.5 kV和(ESI-)3.0 kV，鞘气流速：35 L/min，辅助气流量：10 L/min，离子传输管温度：300 ℃，辅助气温度：350 ℃。扫描模式为全扫描/数据依赖二级扫描(Full MS/dd-MS 2)，一级分辨率70 000，二级分辨率17 500。MS/MS模式时，正、负离子模式下的碰撞能量梯度为20、40、60 eV。

1.3.1.4 数据处理

将UPLC-Q-Orbitrap HRMS所采集的原始数据导入到Compound Discoverer 3.0软件进行计算，对原始数据进行峰对齐和峰提取，利用Compound Discoverer 3.0将提取得到的分子离子色谱峰、同位素峰拟合出分子式，将所得结果与数据库mzCloud，mzVault及本地中药成分高分辨质谱数据库OTCML进行匹配，对匹配结果设置过滤参数为峰面积阈值8万，一级准分子离子及二级碎片离子质量偏差5 ppm(1 ppm=1×106)，匹配度分值>80。对过滤后的目标化合物的质谱信息与对照品、相关文献信息比对，进行化合物的鉴定[7-8]。

1.3.2 抗氧化活性测试

1.3.2.1 块菌提取物的制备

将新鲜的假喜马拉雅块菌，冷冻干燥，后将冻干的假喜马拉雅块菌粉碎，称取适量本品粉末(过二号筛)约2 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，精密加入80%甲醇(纯水)50 mL，密塞，称定质量，浸泡1 h，超声处理(150 W，40 kHz)30 min，放冷，称定质量，用80%甲醇(纯水)补足减失的质量，摇匀，过滤，重复上述操作，合并2次滤液后，旋转浓缩至10 mL。后将提取物配制成所需浓度[3]。

1.3.2.2 DPPH自由基清除活性测定

DPPH自由基清除能力测定根据文献描述方法稍作修改[3]。将甲醇、水提取物的不同质量浓度(1～65 mg/mL)的等分试样80 μL与1 mL 25 μg/mL DPPH甲醇溶液混合，剧烈摇动混合物，黑暗条件下，静置30 min，以96孔板为反应载体，酶标仪在517 nm 处检测其OD值。以维生素C为阳性对照，每个样品平行测定3次，取平均值。根据公式(1)计算块菌提取物对DPPH自由基的清除率：

(1)

式中：A0为空白对照的OD值，Ai为加入样品或者阳性对照后的OD值。

1.3.2.3 ABTS阳离子自由基清除活性测定

ABTS阳离子自由基清除能力测定参照文献稍作改动[3]，配制7 mmol/L ABTS阳离子和4.9 mmol/L过硫酸钾溶液，等体积混合均匀，室温避光贮存12 h以上，根据吸光度用无水乙醇稀释40～60倍至吸光度为0.7±0.02，即为ABTS阳离子储备液。将 0.2 mL ABTS阳离子储备液与10 μL不同质量浓度(0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/mL)的块菌提取液混合，常温避光静置6 min，以96孔板为反应载体，酶标仪734 nm处测定OD值，每个样品平行测定3次，取平均值，用等量的超纯水代替样品作为空白对照，维生素C作阳性对照，根据公式(2)计算ABTS阳离子自由基清除率。

(2)

式中：A0为空白对照的OD值，Ai为加入样品或者阳性对照后的OD值。

1.3.2.4 羟自由基清除活性测定

羟自由基清除能力测定参照文献的方法稍作修改[3]。分别移取20 mmol/L水杨酸钠0.3 mL和1.5 mmol/L的硫酸亚铁1.0 mL于各试管中，再分别加入不同质量浓度(2～12 mg/mL)的块菌样品提取液1.0 mL，最后加入0.7 mL mmol/L H2O2，迅速混匀，37 ℃恒温水浴1 h，以96孔板为反应载体，酶标仪在510 nm下测定其OD值。每个样品平行测定3次，取其平均值。以80%甲醇作为空白对照，维生素C作为阳性对照。根据公式(3)计算块菌提取物对羟自由基的清除率：

(3)

1.3.2.5 还原能力测定

还原能力测定参照文献[3]方法。将不同浓度的块菌样品提取液1 mL与2.5 mL磷酸缓冲液(200 mmol/L，pH 6.6)混合，加入10 g/L铁氰化钾溶液2.5 mL，混合物于50 ℃恒温20 min后加入1 mL 100 g/L三氯乙酸，3 000 r/min离心分离10 min，取上层清液2.5 mL，加入去离子水2.5 mL以及1 g/L新鲜配制的三氯化铁溶液0.5 mL，酶标仪700 nm处测定其OD值。OD值越高，说明反应混合物的还原性越强，每个样品平行测3次，取其平均值。用维生素C作为阳性对照，用等量的超纯水代替样品作为空白对照。

1.3.2.6 总酚含量的测定

总酚含量测定参照文献[3]方法稍作修改。将1 mL 质量浓度为8 mg/mL的块菌样品溶液与1 mL福林酚混合，静置3 min后，加入1 mL 350 g/L碳酸钠，然后加入去离子水使反应体系稀释至10 mL。混匀，室温下黑暗处放置90 min，酶标仪725 nm处测定其OD值。利用不同质量浓度(0.005、0.01、0.02、0.03、0.04 mg/mL)的没食子酸标准品(gallic acid equivalent, GAE)建立标准曲线计算块菌样品溶液中相应的总酚含量。每个样品平行测定3次，取其平均值。

1.3.2.7 数据处理

本文所用数据为3次平行测量，结果以平均值±标准偏差表示。各个数据均用Origin 9.0软件处理作图，采用SPSS 25.0统计分析软件对数据进行分析。数据比较采用t检验，P<0.05时认为样本间具有显著性差异；采用Pearson′s相关分析抗氧化活性与活性成分含量之间相关性[3]。

2 结果与分析

2.1 假喜马拉雅块菌的化学成分分析

假喜马拉雅块菌作为一种食药用真菌，不仅风味独特，也具有极高的营养价值，采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析假喜马拉雅块菌80%甲醇提取物的营养成分，根据化合物的保留时间、一级准分子离子及二级碎片离子质量等信息，结合参考文献和数据库(mzCloud，mzVault)对其成分进行初步鉴定。初步鉴定出51种化合物，包括13个氨基酸、11个有机酸、8个核苷类、9个酰胺类及10个其他类。经与对照品比对其中8个成分可准确鉴定，正负离子流图见图1、图2，化合物的相关信息见表1。

图1 假喜马拉雅块菌在UPLC-Q-Orbitrap HRMS 正离子模式下的总离子流Fig.1 Total ion chromatogram of Tuber pesudohimalayense by UPLC-Q-Orbitrap HRMS in positive ion mode

图2 假喜马拉雅块菌在UPLC-Q-Orbitrap HRMS负离子 模式下的总离子流Fig.2 Total ion chromatogram of Tuber pesudohimalayense by UPLC-Q-Orbitrap HRMS in negative ion mode

2.2 各类化合物的裂解特征

2.2.1 氨基酸

氨基酸分子含有氨基和羧基2种官能团，保留时间主要集中在0.84～3.92 min，正离子模式下，氨基酸的准分子离子峰[M+H]+相对丰度较低，易失去H2O、CO、COOH、NH3(18、28、46、17)形成稳定的特征碎片，通过与数据库及参考文献比对，在假喜马拉雅块菌中推断出13个氨基酸，以DL-精氨酸为例，在ESI+模式下准分子离子峰175.119 1 [M+H]+，推测分子式为C6H14N4O2，在该化合物的二级质谱中丢失1个NH3，形成离子碎片为158.092 2 [M+H-NH3]，丢失1个羧基，形成离子碎片130.097 3 [M+H-COOH]，继续高能碰撞连续裂解失去1个亚甲基，形成碎片离子116.070 7 [M+H-COOH-CH2]，综上与文献[4-8]报道一致，因此推断该化学成分为DL-精氨酸。

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表1 假喜马拉雅块菌在UPLC-Q-Orbitrap HRMS正负离子模式下的化学成分鉴定Table 1 Identification of chemical constituents in Tuber pesudohimalayense by UPLC-Q-Orbitrap HRMS in positive and negative ion mode

续表1

2.2.2 有机酸

本实验中在正负离子模式下，通过与数据库及参考文献比对，共推断出11个有机酸类化合物，有机酸类化合物易丢失H2O、HCOOH、CO2等中性分子形成稳定的碎片离子。以化合物苯甲酸为例，在ESI+模式下准分子离子峰123.043 9[M+H]+，推测分子式为C7H6O2，正离子模式下丢失1个H2O，形成离子碎片105.045 1[M+H-H2O]，连续裂解丢失1个CO，形成碎片离子95.049 4[M+H-CO]，通过与文献[9-11,13]比对，推断该化合物为苯甲酸。

2.2.3 核苷类

核苷类物质是生命活动过程中的重要代谢产物，具有多样生理活性，在抗肿瘤、保护心肌损伤等生命调节过程中起着重要作用。根据碱基不同，将核苷类物质分为嘧啶核苷及嘌呤核苷。本实验中核苷类成分保留时间在1.1～3.75 min，在正离子模式下根据文献及数据库比对推断出8种核苷类成分，以腺苷为例，在ESI+模式下准分子离子峰268.104 3[M+H]+，根据数据库匹配出分子式为C10H13N5O4，二级质谱出现136.060 6、119.034 1质谱峰，推测该化合物为腺苷，二级碎片离子为[M+H-C5H8O4]+、[M+H-C5H8O4-NH3]+，与文献[12-13]报道一致，因此推断该化学成分为腺苷。

2.2.4 其他类

根据数据库mzCloud，mzVault及本地中药成分高分辨质谱数据库OTCML与文献进行比对，从假喜马拉雅块菌中还推断出芳香醛类、甾醇类、油脂类等一些化合物[13]。

2.3 假喜马拉雅块菌的抗氧化活性测试结果

2.3.1 DPPH自由基清除活性测定

由图3可知，假喜马拉雅块菌醇提水提的提取液对DPPH自由基均有一定的清除能力，且随着样品质量浓度的增大自由基清除率也随之增加，在一定范围内存在量效关系。但与维生素C相比，维生素C的抗氧化能力要明显强于块菌提取物。由图3可以看出，块菌水提的DPPH自由基清除率的平均值要高于块菌80%甲醇提取的平均值。表1列出了各不同溶剂提取物的EC50值(mg/mL)，块菌水提液的EC50值平均为14.97 mg/mL，80%甲醇提取液的EC50值平均为20.90 mg/mL(表2)，对2组数据进行t检验，P<0.05，结果表明，块菌水提DPPH抗氧化活性与80%甲醇提取抗氧化活性有统计学差异。

图3 甲醇提取物、水提物、维生素C的DPPH自由基清除能力Fig.3 DPPH radical scavenging activities of methanolic extracts, aqueous extracts and vitamin C

2.3.2 ABTS阳离子自由基清除活性测定

由图4可知，假喜马拉雅块菌80%甲醇和水提的提取液对ABTS阳离子自由基清除能力随着样品浓度的增大自由基清除率也随之增加，在一定范围内存在量效关系。维生素C在0.062 5～4 mg/mL的质量浓度范围内，自由基清除率无较大波动，维持在90%附近，说明维生素C具有较强的抗氧化活性。假喜马拉雅块菌醇提水提后提取液虽然具有一定自由基清除效果，但是清除效果低于维生素C。由图4可以看出，块菌水提醇提的ABTS阳离子自由基清除率相近，但是块菌水提ABTS阳离子自由基清除率的平均值要略高于块菌80%甲醇提取的平均值。表2列出了各不同溶剂提取物的EC50值(mg/mL)，块菌水提液的EC50值平均为0.19 mg/mL，80%甲醇提取液的EC50值平均为0.26 mg/mL，对2组数据进行t检验，P>0.05，结果表明，块菌水提ABTS抗氧化活性与80%甲醇提取抗氧化活性无统计学差异。

图4 甲醇提取物、水提物、维生素C的ABTS阳离子 自由基清除能力Fig.4 ABTS radical scavenging activities of methanolic extracts, aqueous extracts and vitamin C

2.3.3 羟自由基清除活性测定

由图5可知，假喜马拉雅块菌羟自由基清除能力：维生素C>块菌水提物>块菌80%甲醇提取物,且随着块菌样品浓度的增大自由基清除率也增加，存在量效关系。维生素C在2～12 mg/mL，自由基清除率稳定维持在90%附近，说明维生素C具有较强的抗氧化活性。假喜马拉雅块菌醇提水提后提取液虽然具有一定自由基清除效果，但是清除效果低于维生素C。表2列出了各不同溶剂提取物的EC50值(mg/mL)，块菌水提液的EC50值平均为3.21 mg/mL，80%甲醇提取液的EC50值平均为4.71 mg/mL，对2组数据进行t检验，P<0.05，结果表明，块菌水提抗氧化活性与80%甲醇提取抗氧化活性具有统计学差异。

图5 甲醇提取物、水提物、维生素C的羟自由基清除能力Fig.5 Hydroxyl radical scavenging activities of methanolic extracts, aqueous extracts and vitamin C

2.3.4 还原能力测定

由图6可知，在所测质量浓度范围内，块菌各提取物与维生素C，随着质量浓度的增加，还原能力都逐渐增强，并呈现出较好的量效关系。块菌还原能力大小关系为：维生素C>块菌水提物>块菌80%甲醇提取物，对块菌水提醇提2组数据进行t检验，P<0.05，结果表明，块菌水提抗氧化活性与80%甲醇提取抗氧化活性具有统计学差异。

图6 甲醇提取物、水提物、维生素C的还原能力Fig.6 Reducing power of methanolic extracts, aqueous extracts and vitamin C

2.3.5 总酚含量的测定

通过2种不同的提取溶剂对假喜马拉雅块菌的总酚进行提取，块菌水提总酚含量3.99 mg/g，块菌80%甲醇提取总酚含量为1.87 mg/g(表2)，将不同提取物的总酚含量进行t检验，结果发现，块菌水提物总酚的含量与80%甲醇提取物存在显著性差异，水提物的总酚含量明显高于甲醇提取，水提物的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、羟自由基清除能力与还原能力也高于甲醇提取物，采用Pearson′s分析对抗氧化活性与总酚含量之间相关性进行分析。结果表明酚类物质含量与抗氧化活性存在一定相关性，总酚含量越高，抗氧化能力会越强。

3 结论

通过UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析了假喜马拉雅块菌的化学成分，假喜马拉雅块菌中共鉴定出51种成分，其中氨基酸和有机酸含量较高，近年来，谷氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸等氨基酸也单独作用治疗一些疾病，主要用于治疗肝病疾病、消化道疾病、脑病、心血管病、呼吸道疾病以及用于提高肌肉活力、儿科营养和解毒等[1,4,6]。有机酸一般无特殊生物活性，但是有些天然有机酸，则具有抑菌、降血糖、抗氧化以及调节机体免疫等作用，能够增加冠状动脉血流量、抑制脑组织脂质过氧化物生成、软化血管、还有预防疾病和促进新陈代谢等作用[10]。

表2 假喜马拉雅块菌提取物抗氧化能力的EC50值和总酚含量Table 2 EC50 values obtained in the antioxidant activity assays and contents of total phenolics of different extracts from Tuber pesudohimalayense

抗氧化实验结果显示，同种块菌选择不同提取溶剂，可能会影响获得的抗氧化代谢产物含量，进而影响其抗氧化活性，假喜马拉雅块菌具有显著的清除ABTS阳离子自由基、DPPH自由基、羟自由基的能力，且水提物的自由基清除能力强于甲醇提取物，水提物的还原能力也强于甲醇提取物。通过对水提物和甲醇提取物的总酚含量测定发现，水提物的总酚含量明显高于甲醇提取物，这也说明块菌的抗氧化活性与总酚含量成正相关。

综上，通过对假喜马拉雅块菌的化学成分和抗氧化活性研究，发现块菌可以作为天然抗氧化剂的来源，未来应加快块菌化学成分和药理性质的研究，充分挖掘块菌的食药用价值，把块菌中的有效成分应用于药品、食品、保健品、化妆品中，推进块菌产业发展。