泡酸菜辐照杀菌应用评价

欧雪，敖晓琳*，吴梦西，晏俊玲，刘书亮，陈安均，高鹏，徐飞

1(四川农业大学 食品学院，四川 雅安，625014)2(四川省原子能研究院，四川 成都，610101) 3(辐照保藏四川省重点实验室，四川 成都，610101)4(四川李记乐宝食品有限公司，四川 眉山，620036)

泡酸菜是以新鲜芥菜作为原料，经乳酸菌主导发酵制成的一种传统的发酵蔬菜制品，通常作为佐料应用到各种食品中，比如酸菜鱼，酸菜牛肉面等。由于制作过程其原料不灭菌，因此一些腐败微生物会在酸菜泡制和贮藏过程中引起腐败变质，影响产品的风味和口感，甚至食用安全性[1]。现如今我国大部分生产厂家都是利用热杀菌结合食品防腐剂来实现泡酸菜防腐保鲜，但由于热杀菌会造成泡酸菜质地软化、色泽变暗以及维生素C大量损失等不良影响，因此非热杀菌技术被不断尝试并应用于泡酸菜的杀菌工艺中。辐照技术作为一种新兴的绿色加工技术，因其冷杀菌特点，已经广泛应用于食品加工、化工以及材料等诸多领域。并已经在脱水蔬菜、香料与调味品等领域实现了商业化[2]。已有不少学者对辐照杀菌技术在泡菜方面的运用进行研究。结果表明，2～3 kGy的γ射线辐照泡菜能有效杀灭泡菜中的病原微生物[3]；4～6 kGy的辐照剂量处理四川泡青菜其品质优于传统热杀菌技术[4]；张莉会等[5]的研究结果证明榨菜在5 kGy时感官品质较好；当辐射剂量>7 kGy时，榨菜室温存放3个月后品质显著下降。综上所述，使用辐照处理泡菜的最佳剂量可能是2～6 kGy。

辐照食品的保藏与耐辐照微生物的特性及其灭活条件相关。近年来，关于食品中的耐辐照微生物相继被报道，李姣[6]从香辛料中筛选得到D10值为2.56～3.56 kGy的蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)；樊萍等[7]在辐照处理后的面包中分离到芽孢杆菌属(Bacillussp.)和考克斯菌属(Kocuriasp.)。另外，纪明淮等[8]在食品包装袋中分离得到7种耐辐射微生物。然而，泡酸菜中的耐辐射微生物还未见报道。因此本研究对未杀菌的泡酸菜进行不同辐照剂量杀菌处理，对辐照杀菌后泡酸菜中残存的微生物进行分离鉴定，并研究不同辐照剂量下产品贮藏后的风味品质变化，以期为酸菜辐照杀菌或配合其他杀菌条件处理提供数据支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

泡酸菜(盐质量分数6.0%，总酸0.56 g/100g，亚硝酸盐2.83 mg/kg)，由四川李记酱菜调味品有限公司提供；LB培养基、MRS培养基、PDA培养基，科迈杰生物科技有限公司；氯化钠，北京百灵威科技有限公司；琼脂糖、50×TAE缓冲液，索莱宝生物科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司；PremixTaq聚合酶链式反应预混体系、DL2000 DNA Marker和核酸染料Goldview，北京赛百盛基因技术有限公司；PCR引物合成和产物测序均由成都擎科梓熙生物技术有限公司完成。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1F超净工作台，力辰科技；SORVALL高速离心机，美国科骏仪表有限公司；DZF-6020质构分析仪，北京中兴伟业仪器有限公司；NR10Q手持式色差仪，深圳市三恩时科技有限公司；UV-1800PC紫外分光光度仪，上海美普达仪器有限公司；7890A-5975CGC-MS联用仪，美国安捷伦公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMSPME萃取头，美国Supelco公司；HH-2数显恒温水浴锅，国华(常州)仪器制造有限公司；电热恒温培养箱，上海赫田科学仪器有限公司；60Co-γ射线辐照装置，四川省成都市金核辐照中心。

1.3 实验方法

1.3.1 样品采集与辐照处理

取发酵成熟后的酸菜半成品进行真空包装后立即放入低温保藏箱中运送至辐照中心，将样品置于相同尺寸的纸箱内并摆放整齐，分别设定辐照剂量为2、4、6、8、10 kGy进行辐照杀菌处理。吸收剂量的测定参考JJG 1028—91《使用重铬酸银剂量计测量γ射线水吸收剂量标准方法》，剂量率为35 Gy/min，实际测得吸收剂量分别为1.93、3.84、5.24、8.09、10.07 kGy。未进行辐照处理为对照组，辐照处理后立即进行微生物计数、鉴定。将辐照处理后的泡酸菜与对照组一并放置于室温(25 ℃)贮藏60 d后进行感官、质构、风味品质和微生物数量分析。

1.3.2 感官评价

将未进行辐照与不同剂量辐照后室温贮藏60 d后的泡酸菜进行感官评定，主要从色泽、气味、脆度和滋味4个方面作感官评分，感官评分由10位评审员组成评审小组，评定标准如表1所示。

1.3.3 色差分析

选取各个样品一致的部位，使用色差仪在室温条件下采用取出镜面反射模式进行色泽测定。测试参数分别为亮度值L*、红绿值a*、黄蓝值b*。通过L*、a*、b*值可以计算得出总色差值ΔE值，ΔE计算如公式(1)所示：

(1)

1.3.4 质构分析

取尺寸一致的泡酸菜样品，采用TPA模式、P2探头，质构测定参数为：测前速率1 mm/s、测中速率1 mm/s、测后速率10 mm/s，测试距离固定为5 mm，触发力5 g。每个样品测试9次。

表1 泡酸菜感官评定标准Table 1 Sensory evaluation standard of sauerkrauts

1.3.5 亚硝酸盐含量测定

亚硝酸盐的测定参考GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与亚硝酸的测定》中的分光光度法。

1.3.6 挥发性风味物质测定

参考夏季等[9]的方法，并稍作修改。采用固相微萃取-气相色谱-质谱(headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS)法进行测定，气相色谱条件：不分流进样模式，以氦气作为载气，流速设为1.0 mL/min。升温程序：进样口温度设为250 ℃，进样温度为40 ℃，进样时间设为3 min，以5 ℃/min速率升至150 ℃，保持3 min，再以10 ℃/min速率升至230 ℃，保持3 min；质谱条件：电离方式：电子电离，能量70 eV，离子源温度230 ℃，接口温度250 ℃；质量扫描范围(m/z) 25.00～450.00。定性和定量分析：由GC-MS得到的色谱图，经计算机在标准谱库NIST11中比对检索，选取相似度>80的物质进行定性分析，并准确鉴定出各样品的挥发性成分，采用面积归一化法计算各组分相对含量。

1.3.7 微生物分析

1.3.7.1 辐照样品中微生物的分离、计数

分别用PDA、MRS以及LB培养基筛选样品中不同种类微生物。37 ℃恒温培养48 h后对平板上生长的菌落按照形态特征进行归类并计数，同时挑取不同形态的单个菌落于固体培养基上连续划线分离纯化，油镜下观察细胞形态并做好记录。纯化得到的菌株用甘油保存于-20 ℃冰箱中备用。

1.3.7.2 细菌的分子生物学鉴定

经过培养观察发现，样品中残留微生物均为细菌。因此使用细菌基因组DNA 提取试剂盒(DP302)按照说明书提取总DNA，以提取到的菌体总DNA 为模板，使用细菌16S rDNA 基因通用引物27F与1492R，通过PCR获得该基因的片段。其引物序列为：正向引物P1为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物P2为1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。将扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测产物片段大小，符合要求后送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。序列在NCBI数据库进行Blast比对，并使用Mega 6.0 构建邻接法系统发育树[10]。

1.3.7.3 耐辐照微生物在不同条件下的生长特性

菌株活化后于LB培养基中分别置于不同温度(24、28、37、45、55、70 ℃)，不同盐质量分数(3%、5%、7%、9%)，不同pH值(2.5、3.0、3.5、4.0)下恒温培养24 h后在600 nm下测定OD值。

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2010、SPSS 18.0软件对试验数据进行处理，Origin 8.5制图，所有实验均平行进行3次，结果以均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 感官评价

感官评价综合得分结果如图1所示，不同辐照剂量感官评分差异显著(P<0.05)。2、4 kGy的辐照剂量处理与对照组相比均能够使泡菜保持较好的感官品质，可能是射线通过直接或间接作用于微生物内部的蛋白质、核酸或脂类物质从而有效控制泡酸菜中腐败微生物的生长繁殖，且较低的辐照射线基本不会引起泡酸菜组织内部升温，因此与对照组相比，低辐照剂量处理的泡酸菜在贮藏60 d后能较好地保持原有的感官和营养品质[4]。但辐照剂量≥6 kGy时，感官品质显著下降，特别是10 kGy辐照剂量下，泡酸菜完全丧失泡菜特征风味，口感软烂且有一定辐照异味。原因可能由于高剂量下辐照射线穿透力较强从而加剧泡酸菜中果胶物质的分解使得泡菜过度软化。此外，可能由于高剂量辐照破坏了脂蛋白对叶绿素的保护作用，从而使其叶绿素与有机酸发生化学反应，叶绿素中镁离子脱去后泡酸菜由原来光泽的青色逐渐变为无光泽的褐色[4]。

2.2 泡酸菜的亚硝酸盐含量分析

根据图1可知，较辐照处理前样品中亚硝酸盐含量为2.83 mg/kg而言，样品经过不同辐照杀菌剂量处理并贮藏60 d后亚硝酸盐含量出现一定消长，对照组以及2 kGy辐照剂量处理后亚硝酸盐含量较杀菌前有所上升，4 kGy及以上辐照剂量处理组含量均低于杀菌前。整体而言，随着辐照剂量增加亚硝酸盐含量逐渐降低。研究发现亚硝酸盐含量与硝酸还原酶(nitrate reductase，NR)的活性密切相关[11]。本实验中未进行辐照处理组以及2 kGy辐照剂量处理组的亚硝酸盐含量增加的原因可能辐照剂量过低不足以导致NR失去活性。而当辐照剂量≥4 kGy时NR活性受到抑制，亚硝酸盐含量明显下降。但总体来看，各处理组亚硝酸盐含量均低于国家标准中规定的亚硝酸盐安全限值(20 mg/kg)，因此都可放心食用。

图1 不同辐照剂量处理泡酸菜的感官评分以及亚硝酸盐 含量变化Fig.1 Sensory scores and changes of nitrite content of sauerkrauts treated with different irradiation doses

2.3 辐照泡酸菜贮藏60 d后色差分析

泡酸菜经过室温贮藏60 d后的色差变化如表2所示，与对照组相比，4 kGy辐照杀菌处理后的泡酸菜颜色变暗程度最轻，可能因为辐照处理能降低食品中的大部分酶类活性并抑制微生物的生长繁殖，进而控制泡酸菜褐变[12]。2 kGy辐照杀菌处理与对照组无较大差异，而当辐照剂量达到6 kGy时，辐照剂量越大，泡酸菜颜色变暗越显著(P<0.05)。可能是自由基的作用下碳水化合物氧化成酸类物质使食物pH值降低，或者脂肪等物质被氧化后使泡菜颜色变暗，辐照剂量越大，变暗程度将更加明显[12]。

a*均为负值表示泡酸菜颜色偏绿，辐照处理对红绿程度变化没有较大影响。b*为正表示泡酸菜颜色偏黄，较对照组而言，低辐照剂量处理能降低泡酸菜变黄程度，其中2 kGy辐照处理的泡菜颜色黄色程度最浅，而随着辐照剂量的增加，泡酸菜偏黄的程度也有所增加，可能与辐照射线引起的其他化学反应有关。ΔE表示总色差大小，低辐照剂量(2、4 kGy)处理对泡酸菜在贮藏过程中保持最佳色泽有利。但辐照剂量达到6 kGy及以上时会加剧泡酸菜褐变。

表2 不同辐照剂量处理泡酸菜室温贮藏60 d后色差变化Table 2 Color difference of sauerkrauts treated with different doses of irradiation after 60 d storage at room temperature

2.4 不同辐照处理后泡酸菜的质构特性变化

泡酸菜的质构变化情况如图2所示。与对照相比，辐照剂量4 kGy及以下时能使泡酸菜维持较好的质构特性，但>4 kGy后，辐照剂量越高，泡酸菜的脆度、硬度、咀嚼度均出现显著下降趋势。这可能是因为在一定辐照剂量下，泡酸菜中的果胶等物质原有的结构被破坏，以及一些羰基化合物被氧化成酸类使泡酸菜酸度下降，加速泡酸菜软化。这与王双[13]的研究结果不太一致，他认为当辐照剂量>5 kGy时泡豇豆才能保持较好的脆度。这可能与泡菜中果胶酶和果胶纤维素酶的活性有关，由于原料成熟的程度不同以及微生物产生相应酶类的含量也不同，因此需要的辐照剂量抑制相应酶类活性也有所差异[14]。

图2 不同辐照剂量处理泡酸菜的质构特性变化Fig.2 Changes of texture characteristics of sauerkrauts treated with different irradiation doses

2.5 泡酸菜的风味物质分析

不同辐照剂量处理后形成泡酸菜风味差异的风味物质相对含量变化如表3所示，样品中共检测出89种挥发性成分，其中0、2、4、6 kGy辐照剂量处理后的样品中分别检出50、48、54、53、45和48种风味物质。特征性挥发性风味成分不同造成样品的风味存在一定差异。含硫化合物的风味阈值较低，因此在低含量下对泡菜风味也有较大贡献，其中异硫氰酸烯丙酯是芥菜等十字花科植物中硫代葡萄糖苷类物质在葡萄糖苷酶水解后形成的一类化合物[9]。而原料中自带的醇类化合物被氧化成二甲基三硫等物质具有特殊的辛香味[15]。相对于对照组而言，当采用4 kGy辐照处理时，二甲基三硫和异硫氰酸烯丙酯相对含量均达到最大值分别为0.033%和0.036%，但辐照剂量>4 kGy时含量逐渐降低。烯烃类化合物(除萜类烯烃外)大部分来自于原料本身，低辐照剂量处理能显著降低他们在贮藏过程中的损失，但高辐照剂量下可能会破坏碳碳双键导致该类物质降解或者生成其他类化合物[16]。醛类物质中，癸醛、正辛醛、壬醛、β-环柠檬醛等具有果香、花香[17]，其在6 kGy 辐照处理下相对含量达到最大，低于或高于6 kGy 的辐照剂量处理下酸菜中该类物质相对含量明显降低。(E)-2-庚烯醛是脂质氧化降解后形成的化合物[18]，仅在8、10 kGy辐照剂量下检测出，因此该物质可能是高辐照剂量处理后泡酸菜存在辐照异味的主要原因。酯类物质能赋予泡酸菜酯香、水果香等风味[19]，辐照剂量达到6 kGy时能较大程度保留此类物质，但辐照剂量过高此类化合物的含量会有所减少。醇类物质主要有苯乙醇、糠醇、桉叶油醇和叶醇等化合物，辐照杀菌处理后的泡酸菜中醇类化合物相对含量均有所下降，且辐照剂量越高剂量下降越明显。可能是由于辐照射线使泡酸菜中醇类物质发生氧化作用生成醛类、硫化物以及挥发性胺类物质[12]。总的来说，低剂量辐照处理可以减少特征风味物质的流失，但辐照剂量>6 kGy时不但会影响泡酸菜特征风味而且还会形成其他不良异味，严重影响泡酸菜风味品质。

2.6 耐辐照微生物的分子生物学鉴定

从不同辐照剂量处理的泡酸菜样品中共筛选出25株细菌，通过菌落形态和显微结果对比，将其中7株具有形态结构差异的菌种进行分子生物学的方法进行鉴定。通过16S rDNA序列比后制作系统发育树如图3所示，根据序列同源性分析，菌株共隶属于7个种，分别为溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、海考克式菌(Kocuriamarina)、香鱼假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)、亚麻短杆菌(Brevibacteriumlinens)、库利金杆菌(Chryseobacteriumculicis)，其中芽孢杆菌属是优势菌，占菌落总数的33%。根据研究发现引起泡菜腐败的微生物中多以芽孢杆菌属和葡萄球菌属为主[20]，虽然在泡酸菜中数量不多，但他们仍对泡酸菜的品质和安全存在一定影响。此外，虽然一些耐辐照微生物具有一定危险性，但随着辐照杀菌技术的广泛运用，这些具有一定抗逆性的微生物是极具开发与应用前景的微生物资源[21]。因此分离这些具备抗辐射性微生物具有重要研究价值。

表3 不同辐照剂量处理泡酸菜中特征风味物质相对含量变化 单位：%

图3 基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA gene sequence

2.7 辐照泡酸菜中微生物残存情况

经过计数发现各处理组菌落总数均远低于DBS 22/025—2014《食品安全地方标准 酸菜》中微生物的限量规定，但仍然存在一些耐辐照微生物，不同辐照剂量下残存的微生物种类如表4所示。随着辐照剂量的增加泡酸菜中微生物种类逐渐减少，当辐照剂量达到10 kGy时，泡酸菜中未检测出微生物。综合各项指标结果分析，建议泡酸菜的最佳辐照剂量为4 kGy，因其能在保证泡酸菜微生物安全的基础上使其风味物质最大程度保留，并保持最佳的感官品质。因此在4 kGy及以上仍然残存的微生物认为是泡酸菜中最耐辐照微生物，分别是解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、海考克氏菌以及香鱼假单胞菌。虽然这几种微生物数量较少不足以在短时间内缩短泡酸菜产品货架期，但若在泡菜中大量繁殖会导致泡酸菜生花、产生异味、提高亚硝酸盐含量以及褐变等腐败现象[22-23]。

表4 不同辐照剂量处理泡酸菜中残存微生物的种类情况Table 4 The types of residual microorganisms in sauerkrauts treated with different irradiation doses

2.8 耐辐射微生物的生长特性

4 kGy辐照处理后仍残存的微生物在不同条件下的生长情况如表5所示，其中解淀粉芽孢杆菌作为一种益生菌[24]。适宜在偏中性的环境下生长，最适生长温度为28～37 ℃，能够耐受盐质量分数为7%左右的渗透压，可能因为与在一定矿物质离子浓度下能够诱导解淀粉芽孢杆菌芽孢生成提升其存活率有关[25]。假单胞菌是常引起淡水鱼等水产品腐败变质的一类革兰氏阴性菌[22]，渗透压达到7%后停止生长，不耐酸，最适生长温度在28 ℃左右，因其无芽孢生成，因此不耐高温。枯草芽孢杆菌是一种能产芽孢的耗氧细菌，具有较强的抗逆性，能够耐受9%左右的高渗透压，耐酸性强，但在pH 2.5的培养基中无明显生长，最适生长温度37 ℃，且能够耐受70 ℃的高温[26]。海考克氏菌能在3%的盐浓度下大量繁殖，最适pH值和温度分别在4和27 ℃左右。因此，建议在泡酸菜的生产过程中通过控制其酸度并结合短暂巴氏杀菌处理(88～92 ℃)控制大部分耐辐照微生物的生长繁殖。

表5 不同条件下耐辐照微生物的生长情况Table 5 Growth of radiation-tolerant microorganisms under different conditions

3 结论与讨论

综合感官、质构、亚硝酸盐含量和风味物质分析，泡酸菜的最佳辐照剂量在4 kGy左右。用2～4 kGy的辐照剂量处理的泡酸菜脆度、硬度和咀嚼度均优于未杀菌处理组；辐照处理对酸菜中亚硝酸盐含量有显著影响，但均低于国标规定的食用安全限值；低辐照剂量处理有利于泡酸菜保持鲜黄明亮的色泽，而辐照剂量>6 kGy处理时会加剧泡菜褐变；辐照杀菌处理对泡酸菜风味物质保存效果较好，其中4 kGy辐照剂量效果最佳，但辐照剂量超过6 kGy时会出现一些醛类和烷烃类化合物，是形成辐照异味的主要物质。将4 kGy及以上的辐照剂量处理后的泡酸菜中仍然残存的微生物认为是耐辐照微生物，经分离鉴定后其中能引起泡酸菜腐败变质的主要是芽孢杆菌属和假单胞菌属，试验结果显示它们具有较强的抗逆性，因此在保证泡酸菜品质的前提下仍然需要结合其他杀菌方式处理。本实验在泡酸菜中筛选得到的耐辐射微生物已有相关报道，这也证实其在不同介质中均具有较强的耐辐射性能，但其具体的抗辐射机理以及其对泡菜的品质变化仍需要更进一步的研究。