河南淅川酸菜中乳酸菌的分离鉴定及其益生特性初探

程爽，臧晋，王崎锞，杨浩文，邓洲

(1.河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南 南阳 473004；2.南阳理工学院 生物与化学工程学院，河南 南阳 473004)

酸菜是我国传统的发酵食品，因其口味酸爽、营养丰富、增进食欲等特点被人们所喜爱。由于各地原料、制作方法、发酵菌种、发酵时间等存在较大差异，造成了酸菜的口味风格各异。目前我国酸菜的研究主要以东北酸菜[1-3]、四川泡菜[4-6]为主，研究人员针对酸菜的微生物多样性、优良发酵菌种选育、加工工艺、品质控制等方面展开了较深入细致的研究。李欣蔚等[7]利用高通量测序技术对来自东北16个地区的自然发酵酸菜样品中细菌多样性进行了分析，结果表明乳酸杆菌属(Lactobacillus)是东北自然发酵酸菜中的优势菌属，来源于松原和大庆的样品中细菌多样性较为丰富。马长路等[8]从自然发酵东北酸菜中分离到10株乳酸菌，并对其降解胆固醇能力进行了研究，其中植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)MHS1701的胆固醇降解能力为41%，可耐受11.95%的胆盐，具有一定的应用价值。李恒等[9]对不同发酵阶段的传统四川泡菜母水中微生物群落进行了分析，结果表明发酵前期主要优势细菌的多样性较好，Lactobacillus在整个发酵周期均为优势种群。毛丙永等[10]对8份四川老卤泡菜的pH值、总酸、总糖、NaCl浓度、总氮等理化指标进行了测定，并通过GC-MS对其中的挥发性和非挥发性成分进行了分析，结果表明老卤泡菜的主要挥发性成分是烷烃和酯类等具有水果香味的物质；利用纯培养方式从中分离得到36株菌，其中植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)为优势菌株(占分离菌株的88.8%)。

河南省淅川县是南水北调中线工程的水源地和渠首所在地，当地居民历来有制作食用酸菜的传统。淅川酸菜多以雪里红(俗称剌菜)、萝卜缨、红薯叶等为主要原料，经过清洗、漂烫、发酵等工序制作而成，成品色泽黄亮，酸汤黏稠，爽口宜人。目前对淅川酸菜的研究鲜有报道，严重制约了淅川酸菜的标准化工业化生产。因此，本文以传统自然发酵淅川酸菜为研究对象，拟从中筛选出用于酸菜发酵的优良菌种，并对其生长及益生特性进行研究，从而为筛选出适宜淅川酸菜的微生物接种剂提供了技术资料。

1 材料与方法

1.1 材料

酸菜：从淅川农户家庭采集到5份自然发酵酸菜，将酸菜及其汁液置于无菌采样袋中，于4 ℃保温冰盒中带回实验室冰箱备用。

1.2 主要试剂与仪器

蛋白胨、牛肉膏、琼脂粉等(均为生物纯)：北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖、Na2HPO4·7H2O、KH2PO4等(均为分析纯)：天津科密欧化学试剂有限公司；人工肠液、人工胃液：福州飞净生物科技有限公司；乳酸菌生理生化鉴定试剂盒:广州环凯科技有限公司；柱式细菌DNA基因组提取试剂盒、PCR及电泳所用试剂：均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

无菌针式过滤器 美国密理博公司；DNP-9052电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；SHA-C水浴振荡器 常州国华电器有限公司；5804R高速冷冻离心机 德国艾本德公司；LDZX-50KBS高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂；CX32三目光学显微镜 奥林巴斯公司；Biodrop超微量紫外可见分光光度计；Biometra T-Professional Standard PCR仪；DYY-7C电泳仪、DYCP-31DN琼脂糖水平电泳槽 北京六一生物科技有限公司；JY04S-3E凝胶成像分析仪 北京君意东方电泳设备有限公司；TU-1901紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 培养基

MRS固体培养基：蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、柠檬酸氢二铵2.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、吐温80 1.0 mL、乙酸钠5.0 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L、琼脂15 g/L、蒸馏水1000 mL、pH 6.2～6.6(在初筛时加入2%的碳酸钙用来观察溶钙圈)。

MRS液体培养基：蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、柠檬酸氢二铵2.0 g/L、葡萄糖 20.0 g/L、吐温80 1.0 mL、乙酸钠5.0 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L、蒸馏水1000 mL、pH 6.2～6.6。

1.4 方法

1.4.1 样品处理

将采集到的酸菜汁液用0.22 μm无菌针式过滤器进行过滤，用于富集酸菜汁液中的微生物，过滤20 mL后，在无菌条件下将滤膜取出置于含有无菌生理盐水的三角瓶中，于37 ℃，150 r/min恒温振荡器中振荡1 h，使滤膜上附着的微生物洗脱分散至无菌水中，即为菌悬液。

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计学处理。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，计数资料以频数及百分率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

1.4.2 菌株分离纯化

将菌悬液用无菌生理盐水进行梯度稀释，得到10-1～10-5CFU/mL不同浓度梯度的稀释液，然后分别采用倾注法和涂布法对乳酸菌进行分离；观察倾注和涂布后的平板，筛选出四周有溶钙圈的菌株，初步认定为乳酸菌，通过观察菌株的菌落形态、颜色、凸起程度、湿润状态等特征初步选出形态有所差异的乳酸菌菌株。观察稀释涂布后的平板，挑选颜色、菌落大小不同且有溶钙环的菌株在MRS培养基上进行划线纯化，直至菌落单一后对菌株进行编号并斜面保藏于4 ℃冰箱中备用。对分离纯化后的菌株进行革兰氏染色并在光学显微镜下观察其显微形态。

1.4.3 菌株分子生物学鉴定

利用生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取分离菌株基因组DNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA质量。若检测合格，以提取基因DNA为模板扩增分离菌株的16S rDNA。扩增引物为27F:5′-AGAGTTTG-ATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGT-TACGACTT-3′。将PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果登录NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)，利用BLAST软件进行比对。

1.4.4 生理生化鉴定

利用广州环凯科技有限公司的乳杆菌生化鉴定试剂盒进行所分离乳酸菌的生理生化鉴定。

1.4.5 生长曲线及产酸量测定

1.4.6 人工胃液耐受能力检测

将活化后长至对数期的菌株用无菌生理盐水于12000 r/min，1 min洗涤3次，并用无菌生理盐水调整至105CFU/mL，各取0.2 mL菌悬液加入1 mL 人工胃液中，于37 ℃温育4 h后取0.1 mL混合液涂布MRS固体培养基平板，每个样品涂布3个平板，同时涂布未处理的对应菌株作为对照，37 ℃培养48 h后计算其存活率。

1.4.7 不同胆盐浓度人工肠液耐受能力检测

以购买的人工肠液为溶剂，分别配制胆盐浓度为0.5，1，3，5 g/mL的人工肠液。将活化后长至对数期的菌株用无菌生理盐水于12000 r/min，1 min洗涤3次，并用无菌生理盐水调整至105CFU/mL，各取0.2 mL菌悬液分别加至以上不同浓度的1 mL人工肠液中，于37 ℃温育4 h后取0.1 mL混合液涂布MRS固体培养基平板，每个样品涂布3个平板，同时涂布未处理的对应菌株作为对照，37 ℃培养48 h后计算其存活率。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离纯化

从5个不同采集地点的酸菜样品中共分离到32株菌，对这32株菌分别进行接触酶试验、革兰氏染色和形态学观察后进行去重复，选取其中革兰氏染色均为阳性、接触酶阴性反应和形态学差异较大的6株菌作为后续研究对象。6株菌的平板菌落形态及显微形态见表1和图1。

表1 分离菌株的形态学特征Table 1 The morphological characteristics of isolated strains

图1 分离菌株的形态学特征Fig.1 The morphological characteristics of isolated strains

2.2 分离乳酸菌的分子生物学鉴定

对分离到的6株菌进行16S rDNA基因的扩增，将其扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图2。

图2 分离菌株的16S rDNA PCR扩增产物电泳图Fig.2 The electrophoretic diagram of 16S rDNA PCR amplification products of isolated strains

由图2可知，分离菌株的目的基因扩增条带单一，无非特异性扩增，与预期大小一致，可进行测序。将分离菌株的16S rDNA测序结果在NCBI网站上进行序列比对，菌株XC-2为副布氏乳杆菌(Lactobacillusparabuchneri)，XC-3为哈尔滨乳杆菌(Lactobacillusharbinensis)，XC-5为短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)，XC-6为副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)，XC-18为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，XC-20为戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)。

分离菌株的16S rDNA序列测序比对结果见表2。

表2 分离菌株的16S rDNA序列测序比对结果Table 2 The sequencing comparison results of 16S rDNA sequences of isolated strains

2.3 分离乳酸菌的生理生化鉴定

利用广州环凯科技有限公司的乳酸菌生理生化试剂盒对XC-2、XC-3、XC-5、XC-6、XC-18和XC-20进行生理生化指标检测，结果见表3。

表3 分离菌株的生理生化鉴定结果Table 3 The results of physiological and biochemical identification of isolated strains

续 表

由表3可知，除菌株XC-20不能水解七叶苷外，其他5株菌均可水解七叶苷；菌株XC-2、XC-5、XC-18可利用纤维二糖；菌株XC-2、XC-3、XC-5、XC-18可利用麦芽糖；菌株XC-6和XC-20可利用甘露醇；菌株XC-2、XC-3、XC-5、XC-20可利用水杨苷；6株菌均不能代谢山梨醇；除XC-20外，其他5株菌均可利用蔗糖；菌株XC-2和XC-6可利用棉子糖；菌株XC-2、XC-3、XC-5、XC-18可利用菊糖；菌株XC-2、XC-5和XC-6可利用乳糖。

2.4 分离菌株的生长曲线及产酸变化

分离菌株在37 ℃下均生长良好，生长趋势见图3。

图3 分离菌株的生长曲线Fig.3 The growth curves of isolated strains

由图3可知，XC-2和XC-3在42 h时已进入稳定期，菌株XC-20在56 h进入稳定期，XC-5、XC-6和XC-18的生长趋势较一致。

图4 分离菌株的产酸曲线Fig.4 The acid-producing curves of isolated strains

由图4可知，6株菌的产酸趋势基本一致，随着发酵周期的延长持续产酸，到44 h时产酸趋于平稳。

2.5 分离菌株的人工胃液耐受能力

人体正常胃液的pH在0.9～1.5之间波动，主要成分有HCl、胃蛋白酶原、脂肪酶、黏蛋白等[11]。胃液中的胃酸能够抑制和杀死大部分进入胃部的细菌，乳酸菌是否能够耐受胃液的强酸环境以及抵御其中酶类对其的消化是衡量其是否具备能够在肠道存活的重要指标，分离菌株的人工胃液耐受能力结果见图5。

图5 分离菌株的人工胃液耐受性Fig.5 The tolerance to artificial gastric fluid of isolated strains

由图5可知，分离到的6株菌均对人工胃液有一定的耐受能力，其中XC-18在37 ℃下经人工胃液处理4 h后仍有70%以上的存活率，说明该菌株对人工胃液有较强的耐受性。

2.6 分离菌株的耐胆盐能力

乳酸菌是否能在人体肠道内定殖并发挥其益生功能，除了要对胃液具有一定耐受能力外，对胆盐的耐受能力也是重要的考察因素之一。人体肠道内的胆盐浓度一般为0.3%～0.5%，本文中选取0.5，1，3，5 mg/L 4个浓度梯度考察分离菌株对胆盐的耐受性，结果见图6。

图6 分离菌株的人工肠液耐受性Fig.6 The tolerance to artificial intestinal fluid of isolated strains

由图6可知，分离到的菌株在胆盐浓度为0.5 mg/L时均有50%以上的存活率，随着胆盐浓度的增加，存活率有不同程度的下降，其中菌株XC-18对胆盐的耐受能力最强，当胆盐浓度为0.5 mg/L时，存活率可达90%，当胆盐浓度升高至5 mg/L时，存活率仍然可达到60%以上。

3 结论

利用MRS培养基从淅川自然发酵酸菜中分离到6株乳酸菌，分别对其进行形态学、生理生化和分子生物学鉴定，并对其生长曲线、产酸能力、人工胃液和人工肠液耐受性进行了研究。通过形态学和分子生物学鉴定，分离到的6株菌分别为副布氏乳杆菌(Lactobacillusparabuchneri)、哈尔滨乳杆菌(Lactobacillusharbinensis)、短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)，说明淅川自然发酵酸菜中的乳酸菌种类丰富，多样性较好。其中植物乳杆菌和副干酪乳杆菌均在我国《可用于食品的菌种名单》[12]和美国食品药品管理局“公认为安全的物质清单”[13]之列，是公认的可用于食品的乳酸菌菌株；通过人工消化液耐受能力的检测，菌株XC-18在人工胃液和人工肠液处理后存活率在6株菌中最高，分别为72.4%和65.7%(胆盐浓度为5 mg/mL时)，说明该菌株具有较强的耐受性，具有较大的益生菌应用潜力。在下一步工作中将对XC-18的抗氧化能力、降解胆固醇能力等其他益生特性进行研究，对其安全性进行评价，为其在发酵食品生产中的应用提供理论依据。