大别山栽培白及不同部位总酚含量测定及其抗氧化活性研究

何晓梅， 陈存武， 宋 程， 乔德亮， 陈 杰， 陈乃富*

(1.皖西学院生物与制药工程学院,安徽 六安 237012；2.植物细胞工程安徽省工程技术研究中心，安徽 六安 237012；3.安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室，安徽 六安 237012)

全世界白及属植物现有9个种群，我国有4种，即白及Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.、华白及Bletillasinensis(Rolfe)Schltr.、黄花白及BletillaochraceaSchltr.和小白及Bletillaformosana(Hayata)Schltr.[1]。白及是我国民间的传统中药，始载于《神农本草经》，为1995、2005年版《中国药典》所收载，主要用于治疗疮疡肿毒、外伤出血、肺伤咳血、吐血和手足皱裂等[2]。白及中含有多糖、酚类、黄酮类、氨基酸及少量的挥发油等[3]化学成分。现代药理研究表明，白及具有止血、保护胃黏膜、抗胃溃疡、促进伤口愈合、抗病原微生物、抗肿瘤、调节免疫等[4-6]作用。总酚类物质主要具有强抗氧化作用，还有抗病毒、抗肿瘤、防辐射、预防心血管疾病、预防老年性病变等作用[7-8]。白及的药理作用和白及中的酚类化合物有关，包括联苄类化合物、二氢菲类化合物、联菲类化合物以及其它菲类衍生物，如丁香树脂酚、谷甾醇、没食子酸等[9]。目前人们对于白及的研究主要集中于白及的种植、加工以及白及生物活性物质多糖的研究，对于白及总酚研究较少且缺乏系统性。由于人为的过度采挖，野生白及资源濒临灭绝，但近几年人工栽培白及产量猛增，这就要求科研工作者加快对白及资源的研究。本研究以大别山栽培紫花三叉白及为实验材料，优化总酚提取工艺，测定不同部位的总酚含量，并研究其抗氧化活性，为白及的进一步开发利用提供参考依据。

1 材料

1.1 药材 白及于2018年采挖于大别山地区霍山县与儿街镇真龙地村，经皖西学院中药学教研室陈乃富教授鉴定为紫花三叉白及。进一步与中国食品药品检定研究院白及对照品(编号121262)进行对比，最终确定为2020年版《中国药典》收录的白及Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f。

1.2 试剂 没食子酸、无水碳酸钠、福林酚、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、维生素C、三氯化铁、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢、抗坏血酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)等均为分析纯。

1.3 仪器 HH-S4数显恒温水浴锅(常州国宇仪器制造有限公司)；UV-4802/4802S紫外可见分光光度计(龙尼柯仪器有限公司)；DGT-G电热鼓风干燥箱(合肥华德利科学器材有限公司)；FA2204N电子分析天平(上海箐海仪器有限公司)；DXF-20C密封型粉碎机(1 000×g，西安宝正实业有限公司)；RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；GL21M高速冷冻离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)。

2 方法

2.1 药材处理 新鲜植株采后洗净，块茎于沸水煮至无白心后切成片，须根、茎、叶切成段，50 ℃干燥，粉碎，过60目筛，常温保藏。

2.2 检测波长确定 参照文献[10-11]，分别制备块茎总酚供试品溶液、没食子酸对照品溶液(0.05 mg/mL)，加入Folin-酚试剂2.0 mL，黑暗中放置10 min后加入5.0 mL 0.5 mol/L Na2CO3溶液，加水至10.0 mL，50 ℃水浴20 min，以双蒸水为对照确定最大吸收波长。

2.3 单因素试验 以块茎总酚含量为评价指标，乙醇体积分数、液料比、提取温度、提取时间和提取次数为影响因素。

2.4 正交试验 根据单因素试验结果设计L9(34)正交试验。

2.5 总酚含量测定 取须根、块茎、茎、叶各3份，每份1.000 g，在80 ℃下用40 mL 60%乙醇回流提取2 h，过滤，收集滤液，滤渣重复上述操作2次，合并滤液，测定总酚含量。

2.6 抗氧化活性研究

2.6.1 白及总酚清除DPPH·能力 参照白子凡、黄申等[12-13]报道改进，以维生素C为对照品，配制0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150 mg/mL总酚溶液，各取1.0 mL，加入4.0 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，混匀后避光反应30 min，以无水乙醇为参比，于517 nm波长处测定吸光度，重复3次，计算抑制率(I)，公式为I=[A0-(Ai-Bi)]/A0×100%，其中A0为4.0 mL DPPH乙醇溶液与1.0 mL蒸馏水混合后的吸光度，Ai为4.0 mL DPPH乙醇溶液与1.0 mL样品溶液混合后的吸光度，Bi为4.0 mL乙醇溶液与1.0 mL样品溶液混合后的吸光度。

2.6.2 白及总酚清除ABTS+·能力 参照高华山、赵康宏等[14-15]报道改进，以维生素C为对照，配制0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL总酚溶液，各取0.5 mL，加入4.5 mL 6 mmol/L ABTS+·工作液，混匀后避光反应30 min，以蒸馏水为参比，于734 nm波长处测定吸光度，重复3次，计算抑制率(I)，公式为I=[A0-(Ai-Bi)]/A0×100%，其中A0为4.5 mL ABTS+·工作液与0.5 mL蒸馏水混合后的吸光度，Ai为4.5 mL ABTS+·工作液与0.5 mL样品溶液混合后的吸光度，Bi为4.5 mL蒸馏水与0.5 mL样品溶液混合后的吸光度。

2.6.3 半抑制浓度(IC50)计算 根据抑制率(I)绘制一元回归方程，计算样品对DPPH·和ABTS+·的IC50[16]。

2.6.4 总还原力测定 采用普鲁士蓝法[17]。以维生素C为对照，配制0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL总酚溶液，各取2.5 mL，加入2.5 mL 0.2 mol/L PBS溶液(pH 6.6)、2.5 mL 1%K3[Fe(CN)6]溶液，混匀，50 ℃水浴20 min，加入2.5 mL 10%TCA混匀，吸取2.5 mL，加2.5 mL蒸馏水、0.5 mL 0.1%FeCl3溶液，混匀，于700 nm波长处检测吸光度。

3 结果

3.1 总酚测定波长 总酚类物质在碱性溶液中可以将福林酚溶液中的钨酸钠还原生成蓝色化合物，该化合物在770 nm附近有最大吸收峰[18]。没食子酸标准品溶液与白及块茎总酚供试品溶液与福林酚溶液反应的光谱扫描图表明，两者最大吸收波长一致。

3.2 单因素试验

3.2.1 乙醇体积分数 图1显示，随着乙醇体积分数的升高，总酚含量先升高后下降，在70%后更明显，这主要是因为总酚为多羟基化合物，具有较强的极性，乙醇体积分数升高会导致溶剂极性下降，从而总酚含量降低。因此，选取50%、60%、70%作为正交试验考察范围。

图1 乙醇体积分数对白及总酚含量的影响

3.2.2 液料比 图2显示，随着液料比增加，总酚含量缓慢上升；随着溶剂用量进一步升高，增大了溶质和溶剂的接触面积，细胞内外溶质的浓度差增大，有利于总酚溶出，当液料比高于35∶1时呈下降趋势，可能是其他物质的溶出也在变多，形成了竞争抑制。因此，选取30∶1、35∶1、40∶1作为正交试验考察范围。

图2 液料比对白及总酚含量的影响

3.2.3 提取温度 图3显示，随着提取温度升高，总酚含量呈现先上升后下降的趋势，在70 ℃时最高；随着温度进一步升高，分子热运动不断增强，总酚溶出量增加，但高于70 ℃时反而降低，可能是总酚被氧化所致。因此，选取60、70、80 ℃作为正交试验考察范围。

图3 提取温度对白及总酚含量的影响

3.2.4 提取时间 图4显示，随着提取时间延长，总酚含量先上升后下降，其原因可能是该成分在溶剂中部分被氧化，同时一些杂质也溶于溶剂中所致。因此，选取1、1.5、2 h作为正交试验考察范围。

图4 提取时间对白及总酚含量的影响

3.2.5 提取次数 图5显示，提取1次后即可得到总含量的80%以上的总酚，综合考虑时间和成本，确定提取次数为1次。

3.3 正交试验 结果、方差分析表分别见表1～2。由此可知，各因素影响程度依次为提取温度>乙醇体积分数>提取时间>液料比，但对总酚含量影响都不显著(P>0.05)；最优工艺为A2B3C3D3，即乙醇体积分数60%，液料比40∶1，提取温度80 ℃，提取时间2 h。在此条件下进行3批验证试验，测得总酚含量为2 788 μg/g。

图5 提取次数对白及总酚含量的影响

表1 试验设计与结果

表2 方差分析

3.4 总酚含量测定 表3显示，不同部位总酚含量依次为叶>须根>茎>块茎。

表3 白及不同部位总酚含量测定结果

3.5 抗氧化活性研究

3.5.1 DPPH·清除能力 图6、表4显示，茎、叶、块茎、须根中总酚都具有清除DPPH·能力，并呈剂量依赖性；IC50依次减小，即抗氧化活性依次增强，并低于或接近相同质量浓度维生素C。

图6 白及总酚清除DPPH·能力

表4 白及不同部位总酚抗氧化活性比较(DPPH·法)

3.5.2 ABTS+·清除能力 图7、表5显示，茎、叶、块茎、须根中总酚对ABTS+·都具有清除能力，并呈剂量依赖性；在质量浓度低于60 μg/mL时，须根IC50最低、叶次之、茎最高，即抗氧化活性依次为须根>叶>块茎>茎，而为60 μg/mL时抗氧化活性依次为须根>块茎>维生素C>叶>茎。

图7 白及总酚清除ABTS+·能力

表5 白及不同部位总酚抗氧化活性比较(ABTS+·法)

3.5.3 总酚还原能力 图8显示，随着茎、叶、块茎、须根总酚质量浓度增加，吸光度逐渐增大，表明其还原能力(即抗氧化活性)逐渐增强，在相同质量浓度下，抗氧化活性依次为须根>维生素C>块茎>叶>茎。

图8 白及总酚还原能力

4 讨论

白及作为一味传统的中药，由于人为的过度采挖和天然生境的破坏，野生白及资源急剧减少，濒临灭绝。本实验以紫花三叉白及为材料，测定白及须根、块茎、茎和叶中的总酚含量。通过单因素和正交实验法优化了白及总酚最优提取条件为乙醇体积分数60%，液料比40∶1，提取温度80 ℃，提取时间2 h，提取1次，测得白及须根总酚含量为(1.34±0.023)%，白及块茎总酚含量为(0.35±0.015)%，白及茎总酚含量为(0.86±0.021)%，白及叶总酚含量为(3.22±0.031)%。结果表明，白及不同部位总酚含量依次为叶>须根>茎>块茎。

酚类物质是植物中广泛存在的抗氧化活性成分。本实验采用DPPH法、ABTS法和普鲁士蓝法测定白及须根、块茎、叶和茎的总酚都具有较强的抗氧化活性，且同浓度的白及须根总酚抗氧化活性优于块茎、叶和茎。由于总酚是酚类化合物的总称，同一浓度下酚类化合物不同组成在一定程度上影响总酚的生物活性。另外，白及不同部位可能存在具有较强的抗氧化活性未知成分，从而影响其抗氧化活性。目前《中国药典》只收载白及块茎，其须根、叶和茎则弃之不用。本研究结果为深度开发和利用白及资源，提高白及的附加值及其天然抗氧化活性物质研究提供科学基础。