槐耳发酵液乙酸乙酯部位化学成分的研究

李可心， 吕建华， 董 婧， 范冬雨， 王英平， 李长田*

(1.吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心，吉林 长春 130118；2.吉林农业大学人参新品种选育与开发国家地方联合工程研究中心，吉林 长春 130118)

槐耳TramesrobiniophilaMurrll.属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌科、栓菌属，是一种珍稀的药用真菌。具有提高免疫力、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性。槐耳多生长在刺槐的死树、活立木、倒木及树桩上，分布在东北、华北、华中和西北地区等少数地区[1]。槐耳中含有大量多糖类化合物，也是其重要的活性成分，多用于抗癌和炎症的治疗，而对槐耳的化学成分研究较少[2]。由于槐耳野生资源稀少，采用发酵技术不仅能够获得大量稳定的次生代谢产物，而且有利于对槐耳的深度开发利用。因此本研究对槐耳发酵液乙酸乙酯提取物进行化学成分分析，从中分离得到16个化合物，所有化合物均为首次从该真菌发酵液中分离得到。

1 材料

500 L发酵罐(大连富森科技有限公司)；AL104电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；MJ-25085H-II生化培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)；YX Q-LS-30SII立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；SW-CJ-2D超净工作台(上海苏净实业有限公司)；QHZ-98B恒温摇床(上海智城分析仪器制造有限公司)；Agilent Technologies半制备型高效液相(美国Agilent公司)；ZMD核磁共振仪600 MHz(德国Bruker公司)。

正向柱色谱硅胶(100～200、200～300目，青岛海洋化工有限公司)；ODS反相色谱填料(50 μm，日本YMC公司)；GH0525010C18A制备型反相色谱柱(250 mm×10 mm，5 μm，北京绿百草科技发展有限公司)。甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、无水乙醇(北京永定化工厂)；色谱级甲醇、乙腈(美国Thermo Fisher Scientific公司)；娃哈哈水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

槐耳菌株(编号BNCC)存放于吉林农业大学中药材学院菌物生态学实验室。

2 提取与分离

将保存在4 ℃冰箱中的槐耳菌种于PDA培养基(马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L、pH 6)上进行转接活化，25 ℃恒温培养箱培养7 d。将活化好的槐耳菌种接种到液体培养基(蔗糖20 g、酵母浸粉2 g、KH2PO42 g、MgSO41 g、蒸馏水1 L、pH 6，接种量12%)，于温度25 ℃，转速150 r/min的条件下培养7 d后转入到400 L发酵培养基中(同液体培养基)，于温度25 ℃在发酵罐中培养20 d得到发酵产物。

将发酵产物进行过滤后得到发酵液250 L，浓缩至50 L，用乙酸乙酯反复萃取(5次，每次12 h)，将萃取液合并浓缩，得到浸膏350 g。

经硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇(100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、0∶100)梯度洗脱，得到6个馏份Fr.1～Fr.6。Fr. 4析出白色沉淀化合物1(10 g)。将Fr.3(50 g)进行ODS反相硅胶色谱柱分离，30%、40%、50%、65%、80%、100%甲醇-水洗脱，得到6个馏份Fr.3.1～Fr.3.6，Fr.3.1～Fr.3.2每个馏份分为6个组分分别为Fr.3.1.1～Fr.3.1.6、Fr. 3.2.1～Fr.3.2.6。Fr.3.2.1进行HPLC半制备分离纯化(乙腈∶水)得到化合物2(7 mg)、将Fr.3.2.2和Fr.3.2.3合并进行HPLC半制备分离纯化得化合物3(5 mg)、4(6 mg)、5(3 mg)。将剩余Fr.4(60 g)进行ODS反相硅胶色谱柱分离，30%、40%、50%、65%、80%、100%甲醇-水洗脱，得到6个馏份Fr.4.1～Fr.4.6，Fr.4.1～Fr.4.2每个馏份分为6个组分分别为Fr.4.1.1～Fr.4.1.6、Fr.4.2.1～Fr.4.2.6、Fr.4.3.1～Fr.4.3.6、Fr.4.5.1～Fr.4.5.6、Fr.4.6.1～Fr.4.6.6，将Fr.4.6.1进行HPLC半制备分离纯化得化合物6(2 mg)；将Fr.4.2.2进行HPLC半制备分离纯化得化合物7(2 mg)、8(2 mg)；将Fr.4.1.5进行HPLC半制备分离纯化得化合物9(6 mg)；将Fr.4.6.3进行HPLC半制备分离纯化得化合物10(5 mg)；将Fr.4.3.1进行HPLC半制备分离纯化得化合物11(7 mg)；将Fr.4.2.1进行HPLC半制备分离纯化得化合物12(5 mg)；将Fr.4.3.3进行HPLC半制备分离纯化得化合物13(3 mg)。将Fr.6(45 g)加入水，用乙酸乙酯萃取(3次，每次12 h)后浓缩，进行ODS反相硅胶色谱柱分离，30%、40%、50%、65%、80%、100%甲醇-水洗脱，得到6个馏份Fr.6.1～Fr.6.6，Fr.6.1～Fr.6.2每个馏份分为6个组分分别为Fr.6.1.1～Fr.6.1.6、Fr.6.2.1～Fr.6.2.6。Fr.6.1.1进行HPLC半制备分离纯化得化合物14(4 mg)；Fr.6.2.1进行HPLC半制备分离纯化得化合物15(5 mg)、16(3 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末(甲醇)，分子式C4H4N2O2，ESI-MSm/z：112.1[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：11.41(2H，brs，1-NH，3-NH)，7.37(1H，d，J=7.6 Hz，H-6)，5.46(1H，d，J=7.6 Hz，H-5)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：165.2(C-4)，152.2(C-2)，142.9(C-6)，101.0(C-5)。以上数据与文献[3]基本一致，故鉴定为尿嘧啶。

化合物2：白色粉末(甲醇)，分子式C8H8O4，ESI-MSm/z：168.2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：7.45(1H，s，H-2)，7.45(1H，d，J=9.8 Hz，H-6)，6.82(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，3.69(3H，s，8-OCH3)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：173.4(C-7)，150.1(C-4)，144.6(C-3)，122.5(C-1)，121.8(C-6)，116.4(C-5)，114.4(C-2)，50.8(-OCH3)。以上数据与文献[4]基本一致，故鉴定为3，4-二羟基苯甲酸甲酯。

化合物3：白色粉末(甲醇)，分子式C7H6O4，ESI-MSm/z：154.1[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.34(1H，s，H-2)，7.29(1H，d，J=8.2 Hz，H-6)，6.78(1H，d，J=8.2 Hz，H-5)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：115.6(C-2)，117.0(C-5)，122.2(C-6)，122.3(C-1)，145.3(C-3)，150.4(C-4)，167.8(C-7)。以上数据与文献[5]基本一致，故鉴定为3，4-二羟基苯甲酸。

化合物4：黄色油状(甲醇)，分子式C9H12O2，ESI-MSm/z：152.2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.35～7.26(4H，m，H-5，6，8，9)，7.25～7.19(1H，m，H-7)，4.28(1H，d，J=6.2 Hz，H-1)，3.65(1H，m，H-2)，0.83(3H，d，J=6.2 Hz，H-3)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：143.5(C-4)，128.1(C-6，8)，127.5(C-5，9)，127.2(C-7)，78.0(C-1)，71.1(C-2)，19.2(C-3)。以上数据与文献[6]基本一致，故鉴定为1-苯基-1，2-丙二醇。

化合物5：白色粉末(甲醇)，分子式C11H18N2O2，ESI-MSm/z：211.1[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：8.00(1H，s，H-8)，4.19(1H，t，J=8.0 Hz，H-6)，4.00(1H，dd，J=7.4，5.2 Hz，H-9)，3.49～3.22(3H，m，H-3，H-5)，2.12(1H，m，H-5)，1.96～1.60(4H，m，H-10，4)，1.35(1H，m，H-11)，0.87(3H，d，J=6.0 Hz，H-12)，0.86(3H，d，J=6.0 Hz，H-13)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：170.8(C-1)，167.0(C-7)，58.9(C-6)，53.1(C-9)，45.3(C-3)，38.2(C-10)，27.9(C-5)，24.5(C-11)，23.3(C-4)，22.9(C-13)，22.4(C-12)。以上数据与文献[7]基本一致，故鉴定为环(亮氨酸-脯氨酸)。

化合物6：白色粉末(甲醇)，分子式C12H14N2O2，ESI-MSm/z：218.3[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：8.11(1H，s，2-NH)，8.01(1H，s，5-NH)，7.28(2H，dd，J=8.0，6.7 Hz，H-3′，5′)，7.25～7.19(1H，m，H-4′)，7.18～7.12(2H，m，H-2′，6′)，4.23～4.09(1H，m，H-6)，3.69～3.58(1H，m，H-3)，3.13(1H，dd，J=13.4，3.7 Hz，H-7)，2.86(1H，dd，J=13.4，4.8 Hz，H-7)，0.47(3H，d，J=7.0 Hz，H-8)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：168.2(C-5)，166.4(C-2)，136.5(C-9)，130.9(C-11，13)，128.5(C-10, 14)，127.2(C-12)，56.6(C-3)，51.0(C-6)，20.2(C-8)。以上数据与文献[8]基本一致，故鉴定为环(苯丙氨酸-丙氨酸)。

化合物7：无色油状(甲醇)，分子式C11H18N2O3，ESI-MSm/z：227.3[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：7.96(1H，s，H-8)，5.09(1H，s，4-OH)，4.28(1H，t，J=4.8 Hz，H-4′)，4.00(1H，brs，H-9)，3.53(1H，dd，J=4.8，12.6 Hz，H-3)，3.21(1H，d，J=12.6 Hz，H-3′)，2.04(1H，dd，J=6.6，13.2 Hz，H-5)，2.01(1H，m，H-10)，1.88(1H，ddd，J=4.8，11.4，13.2 Hz，H-5′)，1.34(1H，m，H-11)，1.28(1H，m，H-11′)，0.98(3H，t，d，J=7.8 Hz，H-13)，0.82(3H，t，J=7.2 Hz，H-12)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：170.5(C-7)，165.3(C-1)，66.8(C-4)，59.1(C-9)，56.7(C-6)，53.8(C-3)，37.2(C-5)，34.8(C-10)，23.9(C-11)，14.9(C-13)，12.3(C-12)。以上数据与文献[9]基本一致，故鉴定为环(4-S-羟基-R-脯氨酸-R-异亮氨酸)。

化合物8：白色粉末(甲醇)，分子式C11H12N2O2，ESI-MSm/z：204.2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：8.14(1H，brs，H-6)，7.88(1H，brs，H-3)，7.28(3H，m，H-3′ -4′ -5′)，7.17(2H，m，H-2′，6′)，4.06(1H，m，H-2)，3.35(1H，dd，J=3.0，18.0 Hz，H-5)，3.09(1H，dd，J=4.2，13.2 Hz，H-7)，2.88(1H，dd，J=4.8，13.8 Hz，H-7′)，2.77(1H，d，J=17.4 Hz，H-5′)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：167.1(C-1)，165.6(C-4)，136.0(C-1′)，130.0(C-2′，6′)，128.1(C-3′，5′)，126.7(C-4′)，55.5(C-2)，43.7(C-5)，38.8(C-7)。以上数据与文献[10]基本一致，故鉴定为环(苯丙氨酸-甘氨酸)。

化合物9：白色粉末(甲醇)，分子式C14H16N2O3，ESI-MSm/z：260.3[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：8.17(1H，d，J=3.8 Hz，8-NH)，7.36～7.22(3H，m，H-2′-4′)，7.18～7.10(2H，m，H-5′，6′)，4.97(1H，s，4-OH)，4.19(1H，t，J=6.0，4.4 Hz，H-4)，4.00(1H，q，J=5.0 Hz，H-9)，3.59(1H，dd，J=12.6，4.8 Hz，H-3)，3.26(1H，dd，J=11.6，6.1 Hz，H-6)，3.06(1H，d，J=12.6 Hz，H-3)，3.04(1H，dd，J=13.6，5.9 Hz，H-10)，2.91(1H，dd，J=13.6，5.0 Hz，H-10)，1.86(1H，dd，J=12.8，6.1 Hz，H-5)，1.69(1H，td，J=12.2，4.4 Hz，H-5)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：169.2(C-7)，165.3(C-1)，136.4(C-1′)，130.2(C-2′-6′)，128.7(C-3′，5′)，127.3(C-4′)，66.5(C-4)，58.4(C-9)，56.0(C-6)，54.5(C-3)，39.8(C-10)，38.3(C-5)。以上数据与文献[11]基本一致，故鉴定为环(D-羟脯氨酸-L苯丙氨酸)。

化合物10：白色粉末(甲醇)，分子式C14H16N2O3，ESI-MSm/z：260.3[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.98(1H，s，8-NH)，7.31～7.19(5H，m，H-2′，3′，4′，5′，6′)，4.40(1H，t，J=5.2 Hz，H-9)，4.31(1H，dd，J=11.2，6.3 Hz，H-6)，4.19(1H，t，J=4.7 Hz，H-4)，3.52(1H，dd，J=12.6，4.8 Hz，H-3)，3.16(1H，d，J=12.6 Hz，H-3)，3.08(1H，dd，J=14.2，5.4 Hz，H-10)，3.01(1H，dd，J=14.2，5.0 Hz，H-10′)，1.94(1H，dd，J=12.8，6.2 Hz，H-5)，1.52(1H，td，J=12.0，4.6 Hz，H-5′)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：35.6(C-10)，37.7(C-5)，54.3(C-3)，56.1(C-9)，57.4(C-6)，67.2(C-4)，126.8(C-4′)，128.4(C-3′，5′)，130.2(C-2′，6′)，137.8(C-1′)，165.7(C-1)，170.0(C-7)。以上数据与文献[11]基本一致，故鉴定为环(L-苯丙氨酸-L羟脯氨酸)。

化合物11：无色晶体(甲醇)，分子式C8H8O3，ESI-MSm/z：152.2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：10.50(s，1H，4-OH)，7.80(2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6)，6.83(2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5)，3.78(3H，s，-COOCH3)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：166.5(C-7)，162.8(C-4)，131.9(C-2)，120.4(C-1)，115.9(C-3)，52.1(COOCH3)。以上数据与文献[12]基本一致，故鉴定为对羟基苯甲酸甲酯。

化合物12：白色粉末(甲醇)，分子式C7H6O3，ESI-MSm/z：138.1[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：7.86(2H，d，J=8.8 Hz，H-2，6)，6.81(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：170.1(-COOH)，163.3(C-4)，133.0(C-2，6)，122.8(C-1)，116.0(C-3，5)。以上数据与文献[13]基本一致，故鉴定为对羟基苯甲酸。

化合物13：白色粉末(甲醇)，分子式C7H6O2，ESI-MSm/z：123.1[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：9.57(1H，S，H-7)，7.76(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，6.90(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：191.4(C-7)，164.0(C-4)，132.1(C-2，6)，128.8(C-1)，115.5(C-3，5)。以上数据与文献[14]基本一致，故鉴定为对羟基苯甲醛。

化合物14：黄色针状晶体(甲醇)，分子式C9H10O4，ESI-MSm/z：182.2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：7.43(1H，s，H-2)，7.41(1H，dd，J=8.0，2.3 Hz，H-6)，6.81(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，4.29(2H，q，J=7.0 Hz，H-8)，1.36(3H，t，J=7.0 Hz，H-9)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：167.2(C-7)，150.3(C-4)，144.8(C-3)，122.2(C-1)，121.4(C-6)，116.0(C-2)，114.5(C-5)，60.4(C-8)，13.3(C-9)。以上数据与文献[15]基本一致，故鉴定为3，4-二羟基苯甲酸乙酯。

化合物15：白色粉末(甲醇)，分子式C9H16N2O2，ESI-MSm/z：184.2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：8.10(1H，brs，H-4)，7.96(1H，brs，H-1)，3.88(1H，q，J=6.0 Hz，H-3)，3.74(1H，m，H-6)，1.85(1H，m，H-8)，1.39(1H，m，H-9)，1.27(1H，d，J=7.2 Hz，H-7)，1.18(1H，m，H-9′)，0.91(1H，d，J=6.6 Hz，H-11)，0.84(1H，t，J=7.2 Hz，H-10)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：168.6(C-2)，166.6(C-5)，58.8(C-6)，49.6(C-3)，38.0(C-8)，24.2(C-9)，15.0(C-11)，11.9，(C-10)。以上数据与文献[16]基本一致，故鉴定为环(丙氨酸-异亮氨酸)。

化合物16：白色粉末(甲醇)，分子式C11H18N2O3，ESI-MSm/z：226.3[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：8.31(1H，d，J=4.8 Hz，H-8)，4.99(1H，s，4-OH)，4.23(1H，m，H-4′)，4.22(1H，m，H-6)，3.62(1H，dt，J=4.8，9.6 Hz，H-9)，3.46(1H，dd，J=3.6，12.0 Hz，H-3)，3.26(1H，dd，J=5.4，12.0 Hz，H-3′)，2.26(1H，ddd，J=5.4，9.0，13.8 Hz，H-5)，2.04(1H，m，H-5′)，1.68(1H，m，H-11)，1.56(1H，m，H-10)，1.43(1H，m，H-10′)，0.91(1H，d，J=6.6 Hz，H-12)，0.87(1H，d，J=6.6 Hz，H-13)；13C-NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ：168.6(C-7)，166.4(C-1)，66.8(C-4)，55.8(C-6)，55.1(C-9)，52.9(C-3)，41.9(C-10)，36.5(C-5)，23.9(C-11)，22.8(C-12)，21.5(C-13)。以上数据与文献[17]基本一致，故鉴定为环(D-亮氨酸-反-4-羟基-L-脯氨酸)。

4 讨论

本研究从槐耳发酵液乙酸乙酯提取物中分离鉴定了16个化合物，包括1个含氮类、1个苯丙素类、6个酚酸类和8个环二肽类，以上化合物均为首次从该真菌发酵液中分离得到。本研究对槐耳进行液体发酵培养时，所用培养基中含有酵母浸粉，其含有蛋白质、氨基酸、肽、多肽、核酸等营养成分。艾洪莲等[18]从黄连内生真菌发酵液中分离出酚酸类和环二肽类化合物，但其液体培养基中未用酵母浸粉。桦褐孔菌和灵芝子实体中也分离出酚酸类和环二肽化合物[19-20]，而槐耳是与桦褐孔菌和灵芝相似的药用真菌，因此，以上均为该真菌中的化合物。酚酸类化合物具有抗肝癌、抗氧化，抗炎、降血脂等作用[21-22]；环二肽化合物具有调节免疫、抗肿瘤、抗真菌等作用[23-24]。因此，推测酚酸类和环二肽类可能为槐耳发酵液乙酸乙酯提取物中主要的有效成分。今后，将继续对分离得到的单体化合物进行活性筛选，以期为槐耳发酵液的深度开发利用提供理论依据。