基于网络药理学与分子对接探究复方鱼腥草合剂抗COVID-19的作用机制

刘玉萍， 屠书梅， 陈 彦*

(1.南京中医药大学附属中西医结合医院，江苏 南京 210028；2.江苏省中医药研究院中药组分与微生态研究中心，江苏 南京 210028；3.江苏大学药学院，江苏 镇江 212013)

以病毒为病原体的病毒性肺炎，不仅具有广泛的传播性，还可导致严重的呼吸系统疾病如严重急性呼吸系统综合征(SARS)、中东呼吸系统综合征(MERS)等，严重者导致死亡[1]。2019年新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情爆发，对人们健康造成了极大损害。中医认为，本病属“疫病”范畴，患者感受疫戾之气，病位在肺，以“湿、热、毒、瘀”为基本病机[2]。国家卫生健康委员会陆续发布更新的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》显示，中医药治疗在方案中发挥了重要作用[3]。

复方鱼腥草合剂由鱼腥草、黄芩、板蓝根、连翘、金银花5味药材组成，方中以鱼腥草为君药，具有清热解毒、利尿除湿、清热止痢的功效；黄芩为臣药，具有清热燥湿、泻火解毒之功；佐药板蓝根具有清热解毒、凉血利咽功效，连翘具有清热解毒、消肿散结功效；金银花具有清热解毒、疏散风热功效，常用于治疗外感风热引起的咽喉疼痛、急性咽炎、扁桃腺炎有风热证候者，临床上防治肺炎具有显著的疗效[4]，但是否对COVID-19有效及其可能机制尚不清楚。

网络药理学能帮助研究者揭示中药复方的配伍规律，分析中药复方的潜在蛋白靶点，为中药寻找新的适应症[5]。本研究拟通过网络药理学，收集复方鱼腥草合剂的可能有效成分及靶标，构建并分析复方鱼腥草合剂的“成分-靶标”网络，并对有效成分与新型冠状肺炎发病机制相关蛋白进行计算机虚拟预测，为复方鱼腥草合剂的治疗新型冠状病毒肺炎的临床应用研究提供理论和实验基础。

1 资料与方法

1.1 成分收集 在TCMSP数据库平台(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)[6]检索框中输入5味组方药材名，收集所有相关成分，分别为鱼腥草50种、黄芩143种、板蓝根169种、连翘150种、金银花236种，其中82种为共有成分，最终得到662种。

1.2 活性成分确定 将TCMSP数据库平台提供的毒药物动力学(ADME)特性模型与文献确认的方式相结合，筛考虑到复方鱼腥草合剂的给药方式为口服给药，故选择口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18、Caco-2渗透性(Caco-2)≥-0.4、药物半衰期(HL)≥4作为筛选条件，收集符合条件的化学成分作为成分集[7]。

1.3 靶标蛋白基因名确定及成分-靶标网络构建 在TCMSP数据库平台(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)中收集成分对应的蛋白名，借助UniProt(https://www.uniprot.org/)等数据库查询靶标蛋白对应基因名，采用Cytoscape 3.6.1软件构建成分-靶点网络，分析化合物和靶点网络。

1.4 富集分析 采用基于DAVID的可视化、可注释、可集成发现商业数据库(QuickGO)，从生物学过程(BP)、细胞成分(CC)、分子功能(MF)3个方面对靶标进行基因本体(GO)分析，将筛选得到的作用靶标DAVID数据库输入靶标的基因名列表，并限制物种为人源，勾选official gene symbol矫正基因名称，设定P<0.05，进行GO富集、KEGG通路分析。

1.5 成分-靶标分子对接 下载化合物的*mol格式文件，采用Chem Office软件将化合物结构保存为*mol2格式，再经加氢、赋予力场后保存为SD格式。3CLpro、Spike蛋白下载于PDB数据库(https://www.rcsb.org/)，PDB ID分别为6LU7、6VSB，而ACE2来源于文章报道doi.org/10.1101/2020.02.19.956946，蛋白经加氢、准备、赋予力场后，定义3CLpro的原抑制位点为活性位点，Spike和ACE2的相互作用表面为活性位点，采用Discovery studio 3.5平台的CDocker模块进行对接。

2 结果

2.1 活性成分筛选 在“1.2”项筛选条件下，共收集了77种潜在活性成分(图1A)，进一步分析发现，约有47.28%的分子(313/662)具有口服生物利用度，但只有37.01%(245/662)具有较长的半衰期；约有75.22%(498/662)易于被Caco-2细胞单层吸收，48.94%(324/662)具有成药性(图1B)，去掉重复数据，共收集到有77种具有详细ADME参数和结构信息的成分，见表1。其中，MOL000422(山柰酚)、MOL000098(槲皮素)是鱼腥草、连翘、金银花共有成分；MOL001689(金合欢素)、MOL000359(谷甾醇)是黄芩、板蓝根的共有成分；MOL000173(汉黄芩素)是黄芩、连翘共有成分；MOL002914(eriodyctiol flavanone)是黄芩、金银花共有成分；MOL000358(β-谷甾醇)是黄芩、板蓝根、连翘、金银花共有成分；MOL000449(豆甾醇)是黄芩、板蓝根、金银花共有成分；MOL000006(木犀草素)是连翘、金银花共有成分，见图1C、表2。

2.2 靶标收集 共收集到248个相应靶标，分别为鱼腥草218个、黄芩123个、板蓝根87个、连翘219个、金银花218个。

2.3 成分-靶标网络构建 中药复方通常具有多种药理作用，其成分可能作用于多个不同的靶标[8]。本研究构建的成分-靶标网络(图2)包含315个节点、1 062个复合目标交互，但仅显示67种成分，这是因为另外10种成分数据库中报告为无人源性靶标或未报道相关靶标。由此可知，分子MOL000098-槲皮素对应靶标最多(148个)，其次是MOL000422-山柰酚(62个)、MOL000006-木犀草素(57个)、MOL000173-汉黄芩素(44个)、MOL002714-黄芩素(37个)，可能是复方鱼腥草合剂重要活性物质，例如槲皮素、木犀草素、山柰酚分别是鱼腥草、金银花、连翘主要成分，具有抗炎、抗氧化活性，被广泛用于临床治疗肺炎[9-11]；前列腺素G/H合酶2(PTGS2)的潜在配体数量最多(53个)，其次是前列腺素G/H合酶1(PTGS1，49个)、热休克蛋白90(HSP90，45个)。

图1 复方鱼腥草合剂活性成分分布

表1 复方鱼腥草合剂活性成分

续表1

表2 不同中药中的共有成分

2.4 GO富集、KEGG通路分析P<0.05的GO条目共115个，包括BP条目82个，CC条目16个，MF条目17个，分别占比71%、14%、15%，大多与免疫、炎症、细胞过程等有关，排名前20者见图3。

图2 成分-靶标网络图

图3 GO富集分析

P<0.05的KEGG通路共99条，包括HTLV-I infection、epstein-barr virus infection、influenza A、herpes simplex infection、viral carcinogenesis、prion diseases等与病毒感染有关的通路，pertussis(百日咳)、tuberculosis(肺结核)、non-small cell lung cancer、small cell lung cancer等与咳嗽、肺部疾病相关的通路，PI3K-Akt signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、TNF signaling pathway、B cell receptor signaling pathway、toll-like receptor signaling pathway、chemokine signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、cytokine-cytokine receptor interaction等与炎症、免疫系统密切相关的信号通路，排名前20者见图4。

图4 KEGG富集分析

2.5 分子对接 目前，对治疗COVID-19药物靶标的研究主要集中在受体蛋白如血管紧张素酶2(AEC2)、病毒S蛋白(主要是S1蛋白)、病毒复制相关蛋白[如3-胰凝乳样蛋白酶(3CLpro)]等[12-13]。本研究以用排名前4的成分(MOL000422-山柰酚、MOL000006-木犀草素、MOL000173-汉黄芩素、MOL002714-黄芩素)为配体，与AEC2、S蛋白、3CLpro蛋白进行虚拟分子对接，结果见图5、表3。由此可知，这4种成分与上述蛋白均有一定结合能力，并且整体上与3Clpro蛋白原抑制位点的结合键能最低，即结合能力最强。

3 讨论

本研究通过网络药理学，充分利用TCMSP数据库，收集复方鱼腥草合剂已报道的活性成分，充分考虑药物的口服吸收及成药潜力，依据化合物OB、Caco-2、HL、DL值，对复方鱼腥草合剂中进行有效成分的筛选，最终获得77种可能活性成分。进一步对这些活性成分进行预测靶标的收集，基于此绘制并得到了庞大的“成分-靶标”网络图(图2)，每种成分都有对应一个或多个靶标，而每个靶标也都有对应的一种或多种成分，说明中药作用多成分、多靶标、相互协同的作用特点。

对复方鱼腥草合剂成分的靶标进行GO富集分析，得到与炎症、免疫应答相关的多个生物学过程；KEGG富集分析得到与抗病毒、治疗肺部疾病、炎症相关的多个通路(图4)。文献报道，黄芩、板蓝根、金银花、连翘等具有直接对抗病毒的作用；鱼腥草则具有缓解咽痛、咳嗽等急性上呼吸道感染的症状；而金银花、连翘等中药多具有抗炎、抗氧化的作用。因此，经通路分析，本研究认为复方鱼腥草合剂可以通过调节多条信号通路治疗病毒性肺炎。除此之外，在KEGG富集的结果中，本研究还发现了与胰岛素抵抗等糖尿病相关的生物学过程，从本次新型冠状肺炎从报道来看，合并存在某些基础疾病如糖尿病、心脑血管疾病等的中老年人易感[14]。查阅文献发现，鱼腥草可通过抗炎等作用途径改善糖尿病小鼠的肾损伤，减轻糖尿病慢性并发症[15]。因此，本研究认为复方鱼腥草合剂可能有治疗新型冠状病毒性肺炎的潜力，并且可能对具有基础疾病如糖尿病的患者治疗起到一定作用。

图5 核心成分与3种蛋白对接的三维模式图

表3 核心成分与3种蛋白的结合键能量打分

研究表明，新型冠状病毒COVID-19通过其S蛋白上的受体结合域(RBD)与ACE2相结合进入细胞。目前研究表明抗疟药物磷酸氯喹通过干扰ACE2受体的糖基化，抑制病毒与细胞的结合，因而被纳入治疗方案[16]。然而，因其剂量使用大，用药周期长，易导致相关的不良反应，引起了众多学者的注意，更多安全有效的ACE2抑制剂还在进行筛选和研制[17]。病毒的复制和组装过程是病毒成功感染的关键过程，参与这一过程的蛋白成为抗病毒药物研发的另一个策略。其中，3-胰凝乳样蛋白酶(3CLpro)通过参与多肽翻译参与病毒的复制，成为药物研发的靶标。洛匹那韦是3CLpro抑制剂，已应用于新冠肺炎的治疗与临床试验，然而部分学者认为其效果不佳且具有毒副作用[18]。总体来说，尚无具有针对性的特效药，且针对单一靶标的药物疗效不稳定且易产生不良反应。基于KEGG富集分析结果，复方鱼腥草合剂具有较好的抗病毒能力。计算机虚拟对接结果显示复方鱼腥草合剂的核心成分与目前3类研发治疗新冠病毒肺炎的潜在药物靶点ACE2、S蛋白、3CLpro蛋白的对接情况普遍良好，且与3CLpro的对接能力最佳，本研究可以推测复方鱼腥草合剂组方药材的存在具有抗COVID-19作用有效成分，其抗病毒机制可能更倾向于抑制病毒的复制过程。

综上所述，本研究借助网络药理学构建“成分-靶标”网络及计算机虚拟结合技术，初步探索了复方鱼腥草合剂治疗新型冠状病毒肺炎的可能性和生物学途径，分析了核心有效成分的潜在作用机制。还有很多问题需要进一步思考和解决。首先，基于数据挖掘及筛选得到的有效成分与复方鱼腥草合剂最终制剂中的有效成分是否有差别，需要进一步采用分析的手段如质谱等进一步鉴别；其次，本文仅考虑构建了“成分-靶标网络”，新型冠状病毒肺炎引起的呼吸系统甚至是全身器官的损害是复杂的，处于不同发病时期的状态和发病机制也不尽相同，需要进一步构建病毒性肺炎疾病网络，针对性的预测复方鱼腥草合剂的临床试用范围。最后，相关的结果都需要进行进一步的临床和实验验证。