基于网络药理学探究红花注射液治疗原发性痛经的作用机制

戴淑颖， 邵田娱， 吕品秋， 钱燕娜， 张郜晨茜， 叶 平

(1.浙江中医药大学第一临床医学院，浙江 杭州 310053；2.浙江省立同德医院生殖免疫科，浙江 杭州 310012)

原发性痛经在中医中属于“经行腹痛”的范围，常见于青年妇女，指生殖器官无器质性病变，在行经前后或月经期出现下腹部疼痛、坠胀、伴腰酸或有其它不适者[1]。在原发性痛经的共识指南中，建议应用非甾体类抗炎药和口服避孕药作为一线治疗[2]。但部分患者服用后会出现头痛、嗜睡以及消化道反应等副作用，且不适用于备孕的人群。原发性痛经的中医治疗有独特的优势，中药口服、外敷、针灸、推拿等疗法的临床疗效均优于西药治疗，远期疗效明显，且长期应用未发现副作用[3]。

红花属于菊科红花属的一年生草本双子叶植物[4]，《本草纲目》记载其具有活血通经、散肿止痛的功效。现代药理研究表明，红花中的活性成分如羟基红花黄色素A、槲皮素等具有镇痛、扩张冠状动脉、改善心肌缺血、抗凝和抗血栓形成、抗肿瘤等功能[5]。红花注射液是以红花为主要原料、经科学提取精制而成的单一中药注射液[6]，主要用于闭塞性心脑血管疾病、冠心病、脉管炎的治疗。此外有临床研究证明红花注射液穴位注射治疗原发性痛经有良好疗效[7]，可能与红花黄色素这一成分调节前列腺素系统有关[8]。现关于红花注射液治疗原发性痛经的研究多局限于临床，对其多成分多靶点治疗原发性痛经的机制尚未能确切阐明，限制其广泛应用。

近年网络药理学逐渐成为研究多成分中草药的热点，它基于药效学、药代动力学和系统级网络分析，从蛋白质组学水平系统地揭示中草药治疗复杂疾病的多种机制[9]。本研究拟采用网络药理学的方法，借助TCMSP平台[10]、CTD[11]、GeneCards[12]、PharmMapper[13]等疾病靶点数据库搜集活性成分及候选作用靶点，通过cytoscape软件[14]、GeneMANIA平台[15]构建红花注射液活性成分潜在靶点网络、潜在靶点蛋白互作网络(protein-protein interaction，PPI)以及核心靶点与临近基因PPI来挖掘红花注射液治疗原发性痛经的核心靶点，利用ClueGO插件、R语言进行基因本体(GO)及KEGG富集分析，继而在动物模型上验证相关通路及靶点蛋白表达改变。

1 资料与方法

1.1 潜在活性成分及靶点筛选 首先利用TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)平台筛选出红花的有效活性成分及其对应的靶点信息，参数设置按照简化的里宾斯基五规则[相对分子质量(MW)<500、氢键供体(Hdon)≤5、氢键受体(Hacc)≤10、脂水分配系数(Alog P)<5.0、类药比(DL)>0.18][16-17]。将活性成分利用反向对接服务器PharmMapper(http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/)进行模拟分子-靶点对接，靶点范围为“Human Protein Targets Only(v2010，2241)”，其余参数保持默认[18]。筛选标准为分子-靶点匹配度(fit score)，可反映配体构型与药效团模型的叠合情况，选择数值最高的10个靶点[19]。整合通过TCMSP平台和反向对接搜集的靶点。在Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中规范靶点名称为属于人(Homosapiens)的靶点基因名。

1.2 候选靶点蛋白互作网络构建 以“dysmenorrhea”或“primary dysmenorrhea”等关键词搜索CTD(http://ctdbase.org/)、GeneCards(https://auth.lifemapsc.com/)等数据库，获得与原发性痛经相关的基因。与上述靶点基因名进行匹配，其交集为候选作用靶点。通过String数据库(https://string-db.org/，Version11.0)构建候选作用靶点蛋白互作网络，调整“minimum required interaction score”保证可读性，导出网络数据。

1.3 “活性成分-靶点”网络及靶点蛋白互作网络构建 首先将网络数据中基因靶点整合去重，在cytoscape软件(version 3.7.1)中导入网络数据文件中的node1、node2、combined score，利用其工具NetworkAnalyzer进行拓扑分析，筛选节点度值(degree)和介数中心度(betweenness centrality)大于等于所有点中位数值2倍，并满足接近中心度(closeness centrality)大于所有点中位数值的靶点为红花注射液治疗原发性痛经的潜在靶点。再构建潜在靶点与对应红花注射液活性成分的网络图，结合MCODE插件进行聚类分析，筛选核心靶标。然后采用GeneMANIA(http://www.genemania.org)平台构建核心靶标与临近基因的蛋白互作网络，并进行功能富集分析。

1.4 GO、KEGG富集分析 采用RGUI及clusterProfiler对核心靶点进行GO富集分析，包括分子功能(molecular function，MF)、生物学过程(biologica process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)。再利用cytoscape的插件ClueGO、CluePedia对核心靶点进行KEGG富集分析，人工筛选富集网络中的通路节点[20]。将候选作用靶点通过UniProt转换为UniProtID，利用KEGG数据库(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)中的“search&color pathway”工具把候选基因靶点映射到相关通路上。

1.5 动物实验验证

1.5.1 动物 SPF级雌性未孕SD大鼠15只，体质量180～220 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物生产许可证号SCXK(沪)2012-0002，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心，实验前适应性饲养1周，昼夜时间各12 h，自由饮水、摄食，温度(25±2)℃，相对湿度50%～60%。

1.5.2 试剂、药物与仪器 红花注射液(山西华卫药业有限公司，批号16112912)；缩宫素(南京新百药有业限公司，批号11801073)；补佳乐(戊酸雌二醇，德国拜耳公司，批号411A)。TNF-α、IL-6检测试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司，批号EK382HS-24、EK306HS-24)；β-actin(杭州达文生物有限公司，批号DW9562)；PI3K、Akt、STAT3(美国Affinity Bioscience公司，批号AF6241、AF6261、AF6293)；p-Akt、EGFR、p-STAT3、MAPK(美国CST公司，批号4060S、4267S、9145S、4370S)；羊抗鼠、羊抗兔二抗(杭州达文生物有限公司，批号WD-0990、WD-GAR007)。多功能酶标仪(美国Thermo公司)；MP4+ChemidocXRS型蛋白印记检测系统、Western blot套装设备(美国Bio-Rad公司)。

1.5.3 建模与给药 将15只大鼠随机分为空白组、模型组、红花注射液组各5只，通过雌激素和缩宫素联合制备原发性痛经模型[21]。空白组大鼠每天灌胃给予等容积生理盐水，模型组、红花注射液组大鼠每天灌胃给予补佳乐(3 mg/kg)，连续12 d，以提高大鼠对缩宫素的敏感性，同时红花注射液组大鼠腹腔注射红花注射液(3 mL/kg)，空白组、模型组大鼠腹腔注射等容积生理盐水。第12天给药1 h后，模型组、红花注射液组大鼠灌胃给予缩宫素2.5 U/只，造成原发性痛经模型。

1.5.4 指标检测 第12天给予缩宫素后收集大鼠子宫组织，贮存于-80 ℃冰箱中，采用ELISA法检测宫腔组织中炎症因子水平，严格按照试剂盒说明书操作步骤进行。Western blot法检测红花成分-靶点-痛经KEGG富集分析核心通路中蛋白表达。裂解液提取大鼠子宫组织蛋白，测定其浓度，计算上样量，以β-actin为内参调整上样量，保证每个样品孔的蛋白量一致，进行SDS-PAGE电泳，转膜后封闭处理2 h，根据蛋白分子量切割PVDF膜，置入相应一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，洗膜后置入二抗(1∶10 000)，β-actin为羊抗鼠，其余蛋白为羊抗兔，室温孵育2 h，蛋白印记检测仪中曝光，采用Image Lab软件进行灰度值分析，重复3次。

2 结果

2.1 活性成分及靶点 在TCMSP数据库中搜索到红花189种活性成分、1 466个靶点，按“1.1”项下方法筛选得到23种潜在活性成分及对应靶点，在PharmMapper数据库中选取匹配度最高的10个靶点进行整合，删去重复(389个)后共295个，见表1。在Uniprot数据库中规范靶点为对应于人(Homosapiens)的靶点基因名，有1个靶点无法转换。通过比对CTD、GeneCards数据库中原发性痛经有关靶点，保留与其重叠的263个靶点作为候选靶点。

表1 红花注射液潜在活性成分

2.2 核心靶点 在String数据库中输入上述候选靶点，设置“minimum required interaction score”为0.97，得到156个靶点参与的蛋白质互作网络及数据。在cytoscape软件中导入靶点和网络数据中的“combined score”，用NetworkAnalyzer对得到的初始潜在靶点蛋白互作网络分析，得到其节点度值、介数中心度、接近中心度的中位数分别为6、0.004 117 35、0.296 530 3，按“1.1”项下方法筛选，得到潜在靶点43个，见表2。在cytoscape软件中另外构建潜在靶点(菱形)与对应红花注射液活性成分(三角形)的网络图(图1)，节点颜色深浅及边的粗细分别代表代表degree值、combined score值。采用MCODE插件聚类分析，根据得分高低得到4个子网络，选择cluster 1中的13个靶点作为核心靶点，见图2。将核心靶标输入到GeneMANIA平台，得核心靶标与临近基因互作网络及功能富集分析结果，见图3。

图1 “活性成分-潜在靶点”网络图

2.3 GO、KEEG富集分析

2.3.1 GO富集分析 将潜在靶点通过RGUI和clusterProfiler(p-value<0.05、q-value<0.05)进行分子功能(GO-MF)、生物过程(GO-BP)、细胞组分(GO-CC)富集分析，绘制条状图及气泡图，见图4。

2.3.2 KEGG富集分析 将潜在靶点通过ClueGO、CluePedia进行KEGG通路富集分析(p-value<0.05，共111个条目)，选取富集结果中已有文献报道与原发性痛经关系密切的PI3K/Akt及MAPK信号通路[22-23]，映射候选作用靶点，见图5。

表2 红花注射液活性成分潜在靶点

图2 潜在靶点蛋白互作网络(PPI)图

图3 核心靶标与临近基因互作网络图

2.4 大鼠子宫组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)水平 与对照组比较，模型组大鼠子宫组织IL-6水平升高(P<0.05)；与模型组比较，红花注射液组大鼠子宫组织TNF-α、IL-6水平降低(P<0.01)，见表3。

表3 各组大鼠子宫组织TNF-α、IL-6水平比较

2.5 大鼠子宫组织相关蛋白蛋白表达 与对照组比较，模型组大鼠子宫组织PI3K、p-PI3K、p-Akt蛋白表达降低(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，红花注射液组大鼠子宫组织PI3K、p-PI3K、p-Akt蛋白表达升高(P<0.01)。与对照组比较，模型组大鼠子宫组织MAPK、p-STAT3蛋白表达升高(P<0.05，P<0.01)，EGFR蛋白表达无明显变化(P>0.05)；与模型组比较，红花注射液组大鼠子宫组织MAPK、p-STAT3蛋白表达降低(P<0.05，P<0.01)，EGFR蛋白表达无明显变化(P>0.05)。见图6。

图4 GO富集分析

图5 KEGG富集分析

3 讨论

原发性痛经为妇女常见疾病，有报道称其发病率为43%～90%，其中重度痛经约占18%，影响日常生活[24]。《妇人良方大全》提到其主要证型为气滞、血瘀等。而红花有行气化瘀之效，临床疗效。

基于上述实验结果，共得出23个红花注射液活性成分，其中黄芩素[25]、红花黄色素[8]、芹黄素[26]、槲皮素[27-28]均有实验研究证明对于原发性痛经起到治疗作用。通过TCMSP数据库、PharmMapper平台、CTD数据库和GeneCards数据库，筛选出263个候选靶点。核心靶标与临近基因PPI富集分析提示其主要参与调节细胞因子及炎症反应。GO富集分析发现红花注射液活性成分可能通过影响调控细胞周期、蛋白磷酸化过程、调节转录等生物学过程来达到治疗原发性痛经的目的。根据KEGG富集分析结果，发现其可能调控PI3K/Akt、MAPK、EGFR/STAT3等多条信号通路发挥作用。现代研究认为原发性痛经与前列腺素引起子宫高压收缩、缺血以及月经周期中激素水平的变化有关[29]。PI3K-Akt信号通路主要调节细胞增殖和凋亡，当缺血缺氧、缺血再灌注等病理因素作用于细胞时，PI3K/Akt信号通路受到抑制并使其抗凋亡作用减弱[22]。EGFR/STAT3信号通路中，STAT3为急性相应期蛋白以及雌激素效应相关因子[30-31]，有动物实验证明，p-STAT3高表达会导致雌激素过多合成，促进子宫内膜增殖、抑制正常细胞凋亡、增加侵袭性，导致子宫内膜异位症的发生。有研究证明MAPK通路参与神经病理性疼痛的发生机制[23]，激活该通路会促使炎性因子、生长因子等高表达[32]。综上，以上通路可能参与诱发原发性痛经。本研究通过构建大鼠原发性痛经模型来验证上述结果。Western blot结果提示原发性痛经模型组子宫组织中PI3K、p-PI3K、p-Akt蛋白表达降低，MAPK、p-STAT3蛋白表达升高，可能加重原发性痛经，与其他类似研究结果一致。经过红花注射液治疗后，子宫组织中PI3K、p-PI3K、p-Akt蛋白表达升高，MAPK、p-STAT3蛋白表达降低，提示红花注射液可通过调控PI3K/Akt、MAPK、EGFR/STAT3等多条信号通路缓解原发性痛经。根据“活性成分-潜在靶点”的网络信息以及查阅相关文献，核心靶点中的炎症因子TNF-α和IL-6可以刺激绒毛膜的花生四烯酸代谢，后者生成前列腺素类、血栓烷类和白三烯类，从而导致原发性痛经[33]。ELISA结果示模型组大鼠子宫组织中IL-6水平较对照组升高，说明IL-6水平升高是加重原发性痛经的因素之一；红花注射液治疗后，子宫组织中TNF-α、IL-6水平较模型组降低，提示红花注射液可减轻子宫炎症缓解疼痛。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01。图6 各组大鼠子宫组织相关蛋白表达

本研究通过网络药理学的方法，对红花注射液中的活性成分治疗原发性痛经的机制进行探究。红花注射液中的23个潜在活性成分通过调节多个靶点作用于不同通路，提示其多成分多靶点多通路的作用特点，体现了中草药治病的客观优势。本研究发现红花注射液可能通过以下3个方面发挥治疗原发性痛经的作用，①通过激活子宫PI3K/Akt信号通路，促进PI3K、Akt磷酸化，恢复抗凋亡作用，改善子宫缺血缺氧环境；②通过下调EGFR/STAT3信号通路，调控雌激素效应，改善子宫环境；③通过下调MAPK信号通路，降低炎症因子TNF-α、IL-6的表达，抑制子宫炎症反应。

本研究仍有以下不足，首先活性化合物的搜集仅利用TCMSP平台，较为单一，其次分析所得的通路在原发性痛经中已有相关研究，潜在活性成分及靶点与已有文献较为接近，虽然可以表明基于网络药理学的方式探讨红花注射液的作用机制具有一定准确性，但缺乏创新性。本研究的结论仍需要进一步验证，为红花注射液开发应用提供了参考。