基于网络药理学探究敦煌平胃丸对SGC-7901细胞的抑制作用

董娟娟， 李亚玲,， 刘东玲， 李俊杰， 李高勤， 舍雅莉， 刘永琦,,4*

(1.甘肃中医药大学，甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学基础医学院，甘肃 兰州 730000；3.甘肃中医药大学中西医结合学院，甘肃 兰州 730000；4.甘肃中医药大学，敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室，甘肃 兰州 730000)

胃癌是发病率和死亡率分别位居全球第五位和第三位的恶性肿瘤，2015版美国国家综合癌症网络(NCCN)指南显示目前胃癌的治疗仍以手术结合化疗为主。近年来，基于天然药物的抗肿瘤药物是制药研发的热点。敦煌平胃丸出自敦煌古书《不知名氏辨脉法》，方中大黄为君药，附子、干姜、藁本、苦参、桔梗、防风、土鳖虫合而为臣药，当归、人参、玄参同为佐使，该方在临床已用于治疗胃癌及其癌前病变，付航等[1]动物实验证明其治疗胃癌与干预Notch信号通路有关，但其具体机制仍不明确。故本研究拟采用胃癌荷瘤裸鼠模型和网络药理学，初步探讨敦煌平胃丸防治胃癌的疗效及发挥作用的潜在活性分子、靶点和通路，为新的胃癌药物的研发提供理论分析和实验基础。

1 材料

1.1 动物与细胞株 BALB/c裸鼠，SPF级，雌雄各半，体质量18～22 g，共40只，购自甘肃中医药大学动物实验中心，实验动物生产许可证号SCXK(甘)2015-0002。人胃癌细胞株SGC-7901，购自北京北纳创联生物技术研究院。

1.2 试剂、药物与仪器 敦煌平胃丸由大黄、苦参、干姜、藁本、附子、防风、桔梗、土鳖虫、人参、玄参、当归组成，由甘肃中医药大学附属医院提供。顺铂(合肥巴斯夫生物科技有限公司，批号BSF190225，规格50 mg/支)。1640培养液(美国Thermo Fisher Scientific公司，批号AE29247265)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批号19100504)；FITC偶联Annexin-V凋亡检测试剂盒(美国BD公司，批号9312842)。FACSCelesta流式细胞仪(美国BD公司)。

1.3 软件及数据库 TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；TCMID数据库(http://www.megabionet.org/tcmid/)；BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)；TTD数据库(http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp)；HPO数据库(https://hpo.jax.org/app/)；OMIM数据库(https://www.omim.org/)；Drugbank数据库(https://www.drugbank.ca/，version5.1.1)；Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；String数据库(https://string-db.org/，version 10.5)；Uniport数据库(https://www.uniprot.org/)；DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)；OmicShare tool平台 (www.omicshare.com/tools)；cytoscape(version3.7.2)。

2 方法

2.1 动物实验

2.1.1 中药制备 将组方药材饮片用蒸馏水浸泡30 min后，第1次加8倍量水煎煮1.5 h，第2次加6倍量水煎煮1 h，合并煎液，水浴锅浓缩至100 mL，生药量为6 g/mL，置于在4 ℃中冰箱备用。

2.1.2 细胞培养及模型建立 人SGC-7901胃癌细胞培养在含10%胎牛血清的1640培养液中，细胞悬浮液密度为1×107/mL，裸鼠腋下注射0.2 mL/只。给药7 d后，选取瘤体直径大于5 mm的24只裸鼠进行下一步实验。

2.1.3 分组与给药 将造模成功的裸鼠随机分为对照组、顺铂组、敦煌平胃丸组，每组8只，对照组裸鼠灌胃给予0.9%NaCl溶液0.1 mL；顺铂组裸鼠腹腔注射顺铂(20 mg/kg)0.1 mL，敦煌平胃丸组裸鼠灌胃给予药物水煎液30 g/kg，每天1次，连续10 d。所有用药剂量依据人与动物间体表面积折算的等效比值计算所得。

2.1.4 指标检测 第11天裸鼠眼球取血后处死，剥离瘤体，测定瘤体体积V，计算抑瘤率，公式为抑瘤率=(1-V实验组/V对照组)×100%。取一部分瘤体，4%多聚甲醛液固定后石蜡包埋，进行切片和HE染色，在倒置显微镜下观察肿瘤组织和细胞形态。

取部分新鲜移植瘤组织标本至无菌培养皿中，制备瘤体细胞悬液，洗涤2次后在细胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液重悬细胞，使细胞密度达到1×106/mL，吸取100 μL至新管中，加入Annexin V-FITC、PI各5 μL，室温避光孵育后采用流式细胞仪检测凋亡情况。

2.2 网络药理学研究

2.2.1 有效成分筛选 采用TCMSP、TCMID数据库，依次输入11种组方药材，获得全方成分，剔除重复后依据毒药物动力学(ADME)特性，以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为标准筛选有效成分，cytoscape软件构建“药物-有效成分”网络。

2.2.2 有效成分作用靶点及胃癌疾病靶点筛选 采用TCMSP、TCMID、BATMAN-TCM数据库，输入“2.2.1”项下有效成分，得到对应成分靶点。CNKI、万方、NCBI数据库，以“胃癌”为搜索词获得文献来源的靶点,TTD、HPO、OMIM数据库获得数据库来源的靶点，去除重复后整合得到疾病靶点。

2.2.3 可视化网络构建 筛选成分靶点和疾病靶点中的共同靶点，构建“成分靶点-疾病靶点”网络图。采用String数据库，输入上述所得到的成分靶点和疾病靶点，设定交互置信区间>0.9，获得靶点相互作用网络，并将其导入cytoscape。采用Network Analyzer分析网络的拓扑性质，以节点的度数(degree)、介数(betweenness centrality)、紧密度(closeness centrality)为条件，筛选互作网络中重要靶点。采用cytoscape软件中的Mcode插件，以K-Core=2为标准对“成分靶点-疾病靶点”进行分子功能模块聚类分析，得到每个模块的种子靶点。将上述3种方法得到的重要靶点去重后合并，得到“成分靶点-疾病靶点”相互作用网络中的关键靶点，并进行可视化分析。

2.2.4 “药物-关键成分-关键靶点”网络建立 采用TCMSP、TCMID数据库，获得“2.2.3”项下关键靶点(Uniport数据库对名称进行转换)、对应的关键活性成分及活性成分归属药物，采用cytoscape软件建立“药物-关键成分-关键靶点”网络。

2.2.5 GO基因功能注释和KEGG通路富集分析 采用DAVID数据库进行关键靶点的基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析，OmicShare tool对所得结果进行可视化分析。

3 结果

3.1 动物实验

3.1.1 敦煌平胃丸对裸鼠移植瘤体积的影响 与对照组比较，顺铂组、敦煌平胃丸组裸鼠移植瘤体积均降低(P<0.05，P<0.01)，见表1。

表1 敦煌平胃丸对裸鼠移植瘤体积的影响

3.1.2 敦煌平胃丸对裸鼠移植瘤病理形态学的影响 图1显示，对照组裸鼠瘤体细胞排列紊乱，异型性明显，病理性核分裂象多见；顺铂组裸鼠肿瘤细胞排列疏松，异型性较对照组下降，细胞核固缩深染较多；敦煌平胃丸组裸鼠癌细胞排列疏松，异型性较对照组下降，部分细胞见核固缩及核碎裂，瘤体出现小部分坏死。

图1 各组裸鼠移植瘤病理形态学(HE，×400)

3.1.3 敦煌平胃丸对裸鼠移植瘤凋亡率的影响 表2、图2显示，与对照组比较，顺铂组、平胃丸组裸鼠肿瘤细胞凋亡率均增加(P<0.01)。

表2 敦煌平胃丸对裸鼠移植瘤凋亡率的影响

3.2 网络药理学

3.2.1 敦煌平胃丸有效成分 采用TCMSP、TCMID数据库得到全方成分548种，以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为标准筛选得到成分133种，见表3，根据2020年版《中国药典》可知，其中包括大黄质控成分大黄酸、有效成分蒽醌类等，苦参质控、有效成分槐果碱、槐胺碱、苦参碱、槐定碱等，附子质控、有效成分乌头碱、次乌头碱及多种二萜生物碱，干姜、藁本、当归质控、有效成分挥发油，防风质控成分5-O-甲维阿斯米醇和有效成分色原酮类，人参质控成分人参皂苷，玄参质控成分哈巴俄苷等。可能受到现阶段研究成果的限制，导致部分质控成分不符合ADME过程的关键参数OB、DL，如大黄素、大黄酚、桔梗皂苷D、6-姜辣素、升麻素苷、阿魏酸、哈巴苷，故未列在有效成分中。“药物-成分”网络见图3。

表3 敦煌平胃丸有效成分

续表3

续表3

图3 “药物-有效成分”网络图

图4 “成分靶点-疾病靶点”网络图

3.2.2 成分靶点-疾病靶点网络 采用TCMSP、BATMAN-TCM、TCMID数据库对“3.2.1”项下133种有效成分进行对应靶点的检索，去重后得到成分靶点670个；采用HPO、OMIM、TTD、CNKI、万方、NCBI数据库，去重后得到疾病靶点720个，两者共同靶点71个，“成分靶点-疾病靶点”网络见图4。

将2种靶点输入String数据库，交互置信区间>0.9，剔除与胃癌相关性不强的靶点，得到1 202个节点、10 315条边的全靶点互作网络，导入cytoscape软件后，采用Network Analyzer(节点的度数>中位数、介数>0.02、紧密度>0.36)和Mcode插件分析网络的拓扑性质，筛选得到网络中心靶点18个，分别为TP53、Akt1、MAPK1、ESR1、EGFR、INS、STAT3、PIK3CA、GNB1、JUN、SRC、PRKACA、HSP90AA1、CDK1、ITGB1、RAC1、F2、PPP2R1A、CXCL8，见图5。

图5 靶点网络拓扑分析所得中心靶点

采用cytoscape软件中的的Mcode插件对全靶点网络进行聚类，构建功能模块，以K-Core≥2得到分子功能相近的聚类35个(表4)，获得种子靶点(seed node)32个，分别为HTR1F、ADRBK1、FOXM1、Akt1、GABRG1、BCL3、HSD17B2、CHRNB3、CACNA1H、COL11A1、ADH1B、FPGS、TAZ、PRKAR1A、GPC5、SLC9A1、HSP90AA1、TUBB4A、FOXA1、SDHB、PDE10 A、CDA、CHEK2、LEPREL2、EPHA2、GLO1、SOAT2、NR2C2、CD55、RDH13、NPPC、NR1D1。将71个共同靶点与拓扑分析得到的中心靶点、功能模块分析得到的种子靶点合并去重后，得到关键靶点111个，采用cytoscape软件进行拓扑分析，得到PPI网络图(图6)，图中节点颜色越深代表节点的“degree”越高，节点越大代表“betweenness centrality”越高。

3.2.3 敦煌平胃丸与胃癌“药物-成分-关键靶点”网络分析 将“3.2.2”项下靶点分别输入TCMSP、TCMID、Batman-TAM，检索对应的成分，去掉未找到明确成分的靶点后得到关键靶点103个，找到其对应的关键有效成分84种及归属的单味药，统计成分数量(表5)，将关键靶点、对应关键成分、成分归属导入cytoscape软件，得到“药物-成分-关键靶点”网络图(图7)。由此可知，敦煌平胃丸对胃癌的治疗作用是多靶点的，方中除土鳖虫外筛选到多种关键成分干预多个核心靶点，包括大黄、附子、苦参、玄参、人参质量控制成分及大黄中蒽醌类、附子中三萜生物碱、干姜和藁本中挥发油、桔梗中黄酮、防风中色原酮等，可由1种或多种单药提供，并且干预多个靶点，充分体现了中药复方“多点显效，协同增效”的特点。

表4 “成分靶点-疾病靶点”网络的MCODE模块化分析

图6 重要靶点PPI网络图

3.2.4 KEGG通路富集分析 采用DAVID数据库对上述103个关键靶点进行KEGG通路富集分析，发现有与癌症、炎症、免疫等密切相关的通路16 536条，以通路所含靶点数量进行排序，采用OmicShare tool对靶点数量前20的通路进行可视化分析，分别为癌症通路、癌症中的蛋白多糖、PI3K-Akt信号通路、癌症中的MicroRNAs、乙型肝炎、粘着斑通路、前列腺癌、膀胱癌、HIF-1信号通路、胰腺癌、HTLV-I感染、慢性粒细胞白血病、甲状腺激素信号通路、FoxO信号通路、Ras信号通路、黑色素瘤、癌症中的转录失调、病毒的致癌作用、癌症的中心碳代谢、胶质瘤，见图8。

表5 敦煌平胃丸防治胃癌关键靶点、可干预关键靶点的成分数量及其归属

图8 KEGG通路富集分析图

3.2.5 GO富集分析 采用Uniport数据库和OmicShare tool，得到敦煌平胃丸治疗胃癌关键靶点的GO富集，见图9。生物过程(biological process，BP)涉及细胞增殖、发展过程、生物过程的正、负调节、信号传导、多细胞组织过程、生物调控、运动、对刺激的反应、多生物过程、代谢过程、免疫系统过程、生物粘附、节律过程、生长、细胞成分组织或生物发生、生殖过程、繁殖、生物过程调控、定位、解毒、行为、细胞过程、氮素利用、色素沉着；分子功能(molecular function，MF)包含分子功能调节剂、催化活性、转录调节活性、抗氧化活性、分子传感器活性、被劫持的分子功能、结合、转运活性、翻译调节器活动、结构分子活性；细胞成分(cellular component，CC)涉及细胞器部分、细胞器、膜封闭腔、含蛋白质复合物、细胞部分、细胞、突触、细胞外区、膜、突触部分、胞外区部分、细胞连接、其他有机体、其他有机体部分、超分子复合体、膜部件，可见敦煌平胃丸复方关键靶点通过多种生物过程发挥了复杂的分子功能，涉及多种细胞组分。

图9 GO富集分析图

4 讨论

中医讲胃癌病机多为“凝痰聚瘀、胃失和降”。而敦煌平胃丸全方标本兼顾，可治脾胃阳虚脾不运化引起的寒热错杂、气滞血瘀和升降失调，已用于治疗胃癌癌前病变，具有较高的临床价值。且本方来自敦煌遗书的残卷，亦具有重要的史料价值[2]。本研究首先采用胃癌荷瘤裸鼠模型，证实敦煌平胃丸对胃癌移植瘤具有显著的抑瘤作用。同时，实验发现敦煌平胃丸组的裸鼠一般状况较顺铂组良好，提示敦煌平胃丸在发挥抑瘤作用的同时对机体不良影响较小，值得进一步研究开发。但该复方抑制胃癌的物质基础和作用机制尚不清楚。

网络药理学基于系统生物学的理论，从系统的角度和分子的水平上预测中药化合物的靶向和药理作用[3]，可从各层次水平研究药物效果[4]。故本研究采用多个中医药生物信息研究的平台互相补充，筛选敦煌平胃丸治疗胃癌的关键靶点，并将关键靶点对应的活性成分及归属药物进行分析。结果显示，敦煌平胃丸复方含有可能对胃癌挥发治疗作用的成分133种，本研究选择作用靶点大于30的成分，分别是大黄中的大黄酸、芦荟大黄素；附子中的惰碱、去氧穿心莲内酯、次乌头碱、去氧穿心莲内酯；苦参中的去氧穿心莲内酯、臭豆碱、槐胺、槐果碱、槲皮素、8-异戊烯基山柰酚、苦参素；防风中的汉黄芩素；苦参、桔梗中均含有的木犀草素；人参中的菊黄质、石竹胺；当归中的豆甾醇。药理研究显示大黄酸能通过线粒体途径诱导SGC-7901细胞凋亡，影响凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Bcl-xL、pro-caspase-3和炎症相关蛋白TNF-α和白细胞介素6的水平变化[5]。芦荟大黄素通过线粒体凋亡途径和ROS依赖的方式提高AGS肿瘤细胞的细胞毒性[6]。槐果碱是不仅在G0/G1期引起胃癌细胞周期阻滞和细胞凋亡，而且对胃癌细胞PI3K/Akt信号通路有剂量依赖性抑制作用[7]。槲皮素为黄酮类化合物，通过诱导细胞凋亡、坏死、自噬、和抗螺杆菌活性，增强抗癌药物疗效[8]。臭豆碱通过线粒体介导的凋亡途径对人宫颈癌细胞株有抑制增殖作用[9]。苦参素通过抑制NS5A阻断PI3K-Akt-mTOR途径保护肠道黏膜[10]。去氧穿心莲内酯不仅具有抗炎的活性，亦可造成肝和胆管癌细胞G0/G1和G2/M期的细胞周期阻滞[11]。惰碱、次乌头碱、脱氧乌头碱等二萜生物碱对胃癌、肝癌、肺癌等肿瘤细胞的离子通道、物质转运有影响[12]。汉黄芩素能通过VEGFR2酪氨酸磷酸化、STAT3信号通路、钙网蛋白/膜联蛋白A1暴露等影响肿瘤免疫[13]。木犀草素能与姜黄素协同抑制TNF-α引起的炎症[14-15]，豆甾醇一方面通过线粒体介导的细胞凋亡抑制胃癌细胞增殖，另一方面还具有抑制肿瘤细胞迁移和诱导G2/M细胞周期阻滞作用[16]。在这些分子中槐胺、8-异戊烯基山柰酚、菊黄质、石竹胺在胃癌治疗中的具体功能有待进一步研究。在对103个关键靶点进行分析时，本研究得到了对应有效成分大于等于10的关键靶点PTGS2、HSP90AA1、SCN5A、ADRB2、AR、PIM1、SLC6A4、TNF，其中PTGS2已是评估临床I期胃癌患者生存率的生物标记物，参与多条癌症相关的信号通路[17]，并可调节T细胞信号敏感性，改变癌症免疫应答期间CD4+T细胞的行为[18]。HSP90AA1在介导NANOG-TCL1A轴和肿瘤细胞的多侵袭性之间起到关键作用[19]。ADRB2拮抗剂能显著抑制胃癌的生长和转移，并在癌症进展和耐药性中起重要作用[20-21]。癌基因PIM1能通过影响糖酵解关键基因MYC促进癌细胞增殖[22]。SLC6A4在胃黏膜DNA甲基化模式的改变可能与功能性消化不良的发生有关[23]。进一步对重要靶点进行KEGG通路和GO分析显示，富集前20通路为在癌细胞的糖脂代谢、增殖、凋亡、分化、侵袭、转移及微环境调节等多方面发挥作用的重要通路。

综上所述，本研究通过胃癌移植瘤模型证实了敦煌平胃丸对胃癌有明显的抑制效果，再通过网络药理学从胃癌发生发展涉及多靶点、多通路、多步骤的角度分析了敦煌平胃丸治疗胃癌是“多点显效，协同增效”的模式，最终得到有效化学成分与靶系统协同作用的“合”的网络[4]，这为后续进行多种成分的配伍、优化配方提供了实验和理论基础。