红花清肝十三味丸对急性肝损伤大鼠的影响

卢任玲， 马丽杰

(1.山东药品食品职业学院，山东 威海 264210；2.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010059)

急性肝损伤通常是由于微生物感染、滥用药物、过度饮酒等造成的肝功能突然异常，是肝硬化和肝癌的主要始动因素。若未及时治疗会迅速恶化，可能会发展成为急性肝衰竭[1]。目前国内外尚无理想的治疗肝损伤药物，因此开发及筛选有效药物逆转肝损伤的发生发展已成为目前研究的热点。临床上针对急性肝损伤，多采用保肝降酶等治疗方案，以改善其临床症状，促进机体恢复。随着中医药现代化研究进展，中药在治疗急性肝损伤起到了很好的临床疗效，逐渐成为研究热点[2-3]。

红花清肝十三味丸出自《中国医学百科全书·蒙医学》，是由红花、牛黄、紫檀香3味主药，水牛角、木香、栀子、川楝子、诃子、麦冬等10味辅药组成的中药复方制剂。蒙医认为，该复方中的君药红花可以清肝热，调经、活血消肿；栀子、紫檀香可以清血热；银朱可以清脉热；水牛角可以清热、凉血、解毒；麦冬可以清希拉热。各药合用对治疗肝热症及肝功减退有很好的疗效[4]。研究证明，红花清肝十三味丸在临床治疗慢性脂肪性肝炎、慢性乙型肝炎疗效显著[5-6]。然而，在治疗急性肝损伤方面的研究仍然匮乏。本研究旨在建立CCl4诱导的急性肝损伤模型，研究红花清肝十三味丸对急性肝损伤大鼠的保护作用，并初步探究其作用机制，为临床合理用药提供依据。

1 材料

1.1 动物 雄性Wistar大鼠48只，体质量(200±20) g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，动物生产合格证号SCXK-(军)2012-0004，温度20～25 ℃，相对湿度40%～70%，每天光照12 h，自由摄食饮水。

1.2 试剂与药物 红花清肝十三味丸 (批号168172) 购自内蒙古蒙药股份有限公司；水飞蓟宾胶囊 (批号H20040299) 购自天士力制药集团。谷丙转氨酶 (ALT，批号C009-3-1)、碱性磷酸酶 (ALP，批号A059-1-1)、总蛋白 (TP，批号A095-2-1)、丙二醛 (MDA，批号A003-1-2)、过氧化氢酶 (CAT，批号A007-1-1) 检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px，批号BC1195) 检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；TNF-α (批号ab6671)、IL-6 (批号ab208113)、iNOS (批号ab3523)、caspase-3 (批号ab13847)、cleaved caspase-3 (批号ab2302) 抗体购自英国Abcam公司；IL-1β(批号12703s) 购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.3 药物配制 药物研磨成细粉后过筛，加1%吐温80研磨均匀，加蒸馏水溶解并稀释，分别配成质量浓度为0.025、0.05、0.1 g/mL 的红花清肝十三味丸灌胃液和质量浓度为0.01 g/mL的水飞蓟宾灌胃液，用前摇匀。将CCl4与花生油按1∶1比例混匀，配制造模液。

1.4 仪器 CTR6000荧光显微镜(德国Leica公司)；Centrifuge 5415R低温高速离心机(德国Eppendorf公司)；Tanon-5200化学发光成像分析仪(北京原平皓生物技术公司)；Multiskan MK3酶标仪、HM355S全自动石蜡切片机(美国Thermo公司)。

2 方法

2.1 分组及给药 48只大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常对照组，模型组，红花清肝十三味丸低、中、高剂量组 (0.25、0.5 g、1 g/kg，分别相当于临床成人日用量0.5、1、2倍的等效量)，水飞蓟宾组 (0.1 g/kg)，每组8只，正常对照组和模型组灌胃给予蒸馏水，其余各组大鼠灌胃给予相应药物，给药量均为1 mL/100 g，每天1次，持续8 d。

2.2 模型的建立 末次灌胃给药1 h后，正常对照组大鼠腹腔注射1 mL/kg的花生油，模型组、给药组大鼠注射同样剂量的造模液，给药量均为0.1 mL/100 g。大鼠禁食不禁水24 h后，水合氯醛麻醉处死，剥离肝脏。

2.3 生化指标检测 按照试剂盒说明，将各组血液以3 500 r/min离心10 min，取上清液，检测血清ALT、ALP、TP 水平；取大鼠肝脏，制备肝组织匀浆，检测MDA水平及CAT、GSH-Px活性。

2.4 肝组织形态学检测 取大鼠肝脏右小叶组织于10%福尔马林固定后，经组织脱水、透蜡、包埋、切片、脱脂脱蜡后苏木精-伊红(HE)染色，在光学显微镜下观察肝组织结构改变。

2.5 肝细胞凋亡率检测 取少量新鲜大鼠肝组织加入胰酶，恒温37 ℃消化30 min，10%胎牛血清终止消化，收集细胞悬液，800 r/min离心5 min，弃上清，加入PBS洗涤2次，弃上清，加人膜联蛋白V-碘化丙啶(Annexin V-PI) 进行联合染色，上机检测凋亡率。

2.6 肝组织炎症、凋亡蛋白检测 采用Western blot法。取大鼠肝脏组织，加入预冷的RIPA裂解液提取蛋白后测定其浓度，SDS-PAGE凝胶分离蛋白并转移至NC膜上，脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗稀释液，4 ℃冰箱过夜；TBST洗涤3次，加入二抗稀释液，室温孵育1 h，TBST洗涤3次，加入ECL发光液显影和定影，使用Tanon-5200化学发光成像分析仪扫描，统计灰度值并计算相对表达量。以β-actin为内参，结果以待测因子与β-actin条带灰度值的相对比值表示(待测因子正常组比值为1)。

3 结果

3.1 红花清肝十三味丸对大鼠肝功能指标的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠血清ALT、ALP水平升高(P<0.01)；与模型组比较，红花清肝十三味丸组、水飞蓟宾组大鼠两者水平降低(P<0.01)；急性肝损伤后，各组大鼠血清TP水平无显著差异 (P>0.05)，见表1。

表1 红花清肝十三味丸对大鼠肝功能指标的影响

3.2 红花清肝十三味丸对大鼠肝脏氧化应激指标的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠肝脏组织中MDA水平升高 (P<0.01)，CAT、GSH-Px活性降低(P<0.01)；与模型组比较，红花清肝十三味丸组、水飞蓟宾组大鼠肝脏MDA水平降低(P<0.01)，红花清肝十三味丸中、高剂量组和水飞蓟宾组大鼠CAT、GSH-Px活性升高(P<0.01)，见表2。

表2 红花清肝十三味丸对大鼠脏氧化应激指标的影响

3.3 红花清肝十三味丸对大鼠肝脏组织形态学的影响 如图1所示，正常对照组大鼠肝脏小叶结构清晰，小叶肝板排列整齐，未见明显炎症；模型组肝小叶结构紊乱，中央静脉周围多数融合坏死，多数肝细胞肿胀呈气球样变，易见凋亡小体，窦细胞反应活跃，伴混合性炎细胞浸润；而红花清肝十三味丸组和水飞蓟宾组肝小叶损伤程度明显改善，中央静脉周围小坏死灶和凋亡小体明显减少，炎细胞浸润明显减轻。

3.4 红花清肝十三味丸对大鼠肝脏炎症指标的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠肝组织TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的蛋白表达升高 (P<0.01)；与模型组比较，红花清肝十三味丸组、水飞蓟宾组四者蛋白表达降低 (P<0.01)，并呈剂量依赖性，见表3、图2。

3.5 红花清肝十三味丸对大鼠肝细胞凋亡的影响 如表4、图2所示，与正常对照组比较，模型组大鼠肝组织cleaved caspase-3表达升高(P<0.01)；与模型组比较，红花清肝十三味丸组大鼠肝组织cleaved caspase-3表达降低(P<0.01)，但各组caspase-3蛋白表达无显著差异 (P>0.05)。

图1 红花清肝十三味丸对大鼠肝脏组织形态学的影响

表3 红花清肝十三味丸对大鼠肝脏炎症指标的影响

注：A为正常对照组，B为模型组，C为红花清肝十三味丸低剂量组，D为红花清肝十三味丸中剂量组，E为红花清肝十三味丸高剂量组，F为水飞蓟宾组。图2 红花清肝十三味丸对大鼠肝脏炎症和凋亡蛋白表达的影响

表5、图3显示，与正常对照组比较，模型组大鼠肝细胞凋亡率升高(P<0.01)；与模型组比较，红花清肝十三味丸组和水飞蓟宾组肝细胞凋亡率降低(P<0.01)。

4 讨论

肝脏作为人体中最大的消化腺，在机体解毒和主代谢中的作用举足轻重[7]。近年来，中药材被广泛用于治疗肝病。红花清肝十三味丸作为蒙医传统药方，在保肝方面具有极高的药用价值[8]。CCl4可诱导产生大量自由基，破坏肝细胞膜，导致膜通透性增强，最终引起血清ALT和ALP水平升高，二者通常作为诊断肝损伤严重程度的指标[9-10]。研究发现，模型组大鼠血清ALT和ALP水平升高。此外，临床诊断通常通过肝脏病理改变作为急性肝损伤的检验标准。本研究的病理切片染色结果表明，模型组肝小叶结构紊乱，中央静脉周围和小叶周围带可见多数坏死灶，多数肝细胞肿胀呈气球样变，伴混合性炎细胞浸润，窦细胞反应活跃，结合血清指标表明急性肝损伤模型建立成功。而红花清肝十三味丸组能使ALT、ALP 水平降低，且能抑制CCl4引起肝脏的病理学改变和损伤，表明其在保护肝细胞膜稳定性及减轻肝脏损伤程度上起着重要作用。此外，红花清肝十三味丸对蛋白合成相关的TP作用并不显著，这表明其保肝作用并不影响肝脏合成蛋白功能。

表4 红花清肝十三味丸对大鼠肝脏凋亡蛋白的影响

图3 红花清肝十三味丸对大鼠肝细胞凋亡率的影响

表5 红花清肝十三味丸对大鼠肝细胞凋亡率的影响

机体含有多种酶促(例如，GSH-Px和CAT)和非酶促(例如，抗坏血酸)的抗氧化剂，以维持内源性氧化还原平衡。CCl4可通过诱导自由基的产生，使得平衡被打破，造成肝脏发生脂质过氧化反应，导致细胞、线粒体等生物膜的流动性降低，通透性增高，组织内抗氧化酶活性降低，肝脏抵御氧化损伤能力下降，进而引起肝脏损伤[11]。MDA是自由基攻击生物膜多不饱和脂肪酸最终产物，通常用于监测脂质过氧化反应程度[12]。本研究发现，红花清肝十三味丸组能提高CAT、GSH-Px活性，减少MDA积聚，表明药物通过增加抗氧化酶的活力，清除自由基及减少脂质过氧化反应，从而减轻CCl4引起的肝损伤。

大多数肝损伤的病理进程都伴随炎症反应的发生，肝脏氧化应激与炎症的发生密切相关。氧化应激能够激活机体的Kupffer 细胞，释放出大量的促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6等，而这些介质能作用于内皮细胞、肝星状细胞和肝细胞，随后募集免疫细胞以引发炎症反应[13]。此外，当肝组织损伤时，肝脏中大量表达iNOS，催化大量NO产生，参与肝炎的发病过程，对肝脏具有毒性作用[14]。研究发现，红花清肝十三味丸组能够抑制模型组 TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS蛋白的表达，表明药物通过抑制炎症反应减轻CCl4引起的肝损伤。

细胞凋亡在肝炎的产生、发展中的作用至关重要。caspase-3对凋亡具有执行功能，当caspase-3被激活后断裂为cleaved caspase-3片段，则会启动凋亡过程，是凋亡发生的直接原因[15]。本研究发现，模型组肝细胞的凋亡率升高，凋亡蛋白cleaved caspase-3蛋白的表达增加，红花清肝十三味丸组能明显抑制二者的升高，表明药物通过抑制凋亡减轻CCl4引起的肝损伤。

综上所述，红花清肝十三味丸可通过抑制氧化损伤、炎症反应，减轻肝细胞凋亡，来改善大鼠的急性肝损伤。然而，关于红花清肝十三味丸在发挥保肝作用的具体机制有待进一步研究。