银蓝调脂胶囊抗ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的作用

郑柳怡， 甘海宁， 黄丹娥， 李茹月， 杨九妹， 陈玉兴*

(1.广州中医药大学第五临床医学院，广东 广州 510405；2.广东省第二中医院，广东省中医药工程技术研究院，广东 广州 510095；3.广东省中医药研究开发重点实验室，广东 广州 510095)

动脉粥样硬化是以脂质代谢紊乱为疾病基础的一种心血管疾病，发病率高，死亡率高，2015年起全球有1/3人口死于动脉粥样硬化等心血管疾病[1]。肝脏是脂质代谢的主要场所，当摄入胆固醇过多时，肝脏无法将其完全代谢，胆固醇沉积在肝脏并诱导肝脏炎症发生，且多余胆固醇会随着血液循环沉积在动脉壁中，形成斑块[2]。胆固醇逆向转运已然成为治疗动脉粥样硬化的新思路。在胆固醇逆向转运过程中，肝X受体(liver X receptors, LXRs)是关键的核受体转录因子，它将脂质代谢和炎症的关键信号节点连接起来[3]，已有研究证明激活LXR的表达可促进巨噬细胞胆固醇流出，有效缓解炎症以治疗动脉粥样硬化[4]。银蓝调脂胶囊由银杏叶、绞股蓝、化橘红以及蜂胶组成，已有实验证明银蓝调脂胶囊能够降低血清TG、TC等血脂水平，具有调节高血脂症的作用[5]，本实验将基于LXR信号通路继续探讨银蓝调脂胶囊抗动脉粥样硬化疾病的作用机制。

1 材料

1.1 动物 C57BL/6小鼠、ApoE-/-小鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK(京)2016-0006。

1.2 试剂与药物 辛伐他汀片(美国默沙东公司，批号L043451)。银蓝调脂胶囊，由化橘红、银杏叶、绞股蓝和蜂胶组成，化橘红、银杏叶和绞股蓝三药经水煎2次浓缩至0.75 g/mL，再经50%乙醇沉淀并真空干燥得到约15%的干浸膏，取酒制蜂胶和干浸膏，粉碎，过筛，加入药用淀粉适量，混匀，干压制粒，装入胶囊，即得，由广东省中医药工程技术研宄院制剂室生产，批号20170727，使用时按照给药剂量用去离子水配置成所需的药液。氧化型低密度脂蛋白试剂盒(ox-LDL)(天津安诺瑞康生物技术有限公司，批号462180831)；总胆固醇试剂盒(TC)、甘油三酯试剂盒(TG)、低密度脂蛋白试剂盒(LDL-C)(南京建成生物工程研究所，批号20180805、20190704、20190703)；Trizol RNA裂解液(美国英杰公司，批号20180107)；兔单克隆抗体(GAPDH)、肝X受体alpha抗体(LXRα)、ATP结合盒转运子G5抗体(ABCG5)(美国Proteintech公司，批号A5441、14351-1-AP、27722-1-AP)；细胞色素P4507A1抗体(CYP7A1)、诱导型一氧化氮合酶抗体(iNOS)、山羊抗兔IgG抗体(英国Abcam公司，批号ab66153、ab191606、ab97051)；胆固醇调节元件结合因子1c抗体(SREBP-1c)(武汉云克隆科技股份有限公司，批号PAC868Mu01)。

1.3 仪器 Varioskan Flash型全波长多功能酶标仪(美国Thermo公司)；5450型小型高速离心机(德国Eppendorf公司)；JJ3000型电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)；BSA2245型电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；电泳仪、IQTM5型荧光定量PCR仪 (美国Bio-Rad公司)；HH-6数显恒温水浴锅(金坛市富华仪器有限公司)。

2 方法

2.1 剂量换算 银蓝调脂胶囊每粒含0.5 g粉，粉末含生药量4.77 g/g，根据每天3次，每次4粒的服用量，得出人临床生药用量为28.6 g/d，参考《中药药理研究方法学》中剂量换算方法“体表面积比”换算动物临床等效剂量为含生药量3.72 g/kg，作为银蓝调脂胶囊低剂量，临床等效剂量2倍为银蓝调脂胶囊中剂量组(含生药量7.44 g/kg)，4倍为银蓝调脂胶囊高剂量组(含生药量14.88 g/kg)。辛伐他汀片临床剂量为80 mg/d，换算动物临床等效剂量为10.40 mg/kg。

2.2 分组、造模与给药 10只C57BL/6小鼠作为正常组，喂食普通饲料，50只ApoE-/-小鼠作为造模组，喂食高胆固醇鼠饲料(1%胆固醇，15%猪油，3%奶粉，5%鸡蛋黄和76%普通饲料)，喂食12周后，将50只ApoE-/-小鼠随机分成模型组，辛伐他汀片组(10.40 mg/kg)，银蓝调脂胶囊高(14.88 g/kg)、中(7.44 g/kg)、低(3.72 g/kg)剂量组，每组10只。各给药组灌胃给予相对应药物，正常组和模型组灌胃给予等量去离子水，10 mL/kg，每天1次，连续灌胃给药12周。给药期间，正常组喂食普通饲料，其余各组持续喂食高胆固醇鼠饲料。末次给药1 h后，各组小鼠均摘眼球取血，3 000 r/min离心10 min，取血清；取胸主动脉和肝脏左叶部分置于10%甲醛溶液中保存，其余部分肝脏于-80 ℃冰箱储存。

2.3 ApoE-/-小鼠血清ox-LDL水平及胸主动脉脂质斑块面积的检测 使用ELISA试剂盒，按照说明书步骤检测血清ox-LDL水平。除去胸主动脉周围脂肪，于10%甲醛固定48 h后脱水，随后进行油红O染色，利用Image-Pro Plus软件定量分析胸主动脉血管壁上脂质斑块面积。

2.4 ApoE-/-小鼠肝脏TC、TG以及LDL-C水平的检测 使用单试剂GPO-PAP法并通过酶标仪检测肝脏TC、TG以及LDL-C水平。

2.5 ApoE-/-小鼠肝脏脂质面积的检测 将肝脏左叶部分组织固定48 h后，进行脱水、浸蜡、包埋，切片厚度为4 μm，随后进行油红O染色，从每个样本中随机选取3个200倍视野，利用Image-Pro Plus软件定量分析肝脏脂质面积。

2.6 RT-qPCR法检测ApoE-/-小鼠肝脏ABCG5、SR-B1、iNOSmRNA表达 取肝脏组织，采用Trizol法提取肝脏总RNA，逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，根据GenBank提供的基因序列设计特异性引物，引物设计利用Primer 5.0和Beacon Designer 7.91生物软件，见表1，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，通过PCR仪检测各基因的表达。

表1 RT-qPCR相关靶标基因引物序列

2.7 Western blot法检测ApoE-/-小鼠肝脏中LXRα、ABCG5、SREBP-1c、CYP7A1、COX2和iNOS蛋白表达 取小鼠肝脏组织，充分剪碎，加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法检测蛋白质浓度，配平各蛋白样品，加样后进行SDS-PAGE电泳。将凝胶中的蛋白质转移至PVDF上，5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h后，分别加入相应的一抗，在4 ℃下过夜孵育，TBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗，室温摇床孵育1.5 h，TBST洗膜后于ECL暗室化学发光显影，凝胶成像分析系统摄像分析，采用Image J软件检测出所得蛋白图像的目标条带以及相应内参条带灰度值，并计算蛋白表达，蛋白表达=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

3 结果

3.1 银蓝调脂胶囊对ApoE-/-小鼠血清ox-LDL水平的影响 与正常组比较，模型组小鼠血清ox-LDL水平升高(P<0.01)；与模型组比较，银蓝调脂胶囊各剂量组小鼠血清ox-LDL水平均有降低(P<0.01)；银蓝调脂胶囊各剂量组两两比较，ox-LDL水平均无显明显变化(P>0.05)，见表2。

表2 银蓝调脂胶囊对ApoE-/-小鼠血清ox-LDL水平的影响

3.2 银蓝调脂胶囊对ApoE-/-小鼠胸主动脉脂质斑块面积的影响 与正常组比较，模型组小鼠主动脉脂质斑块面积增加(P<0.01)；与模型组比较，银蓝调脂胶囊各剂量组小鼠主动脉脂质斑块面积均减少(P<0.01)；银蓝调脂胶囊各剂量组两两比较，主动脉脂质斑块面积均无明显变化(P>0.05)，见表3。

表3 银蓝调脂胶囊对ApoE-/-小鼠胸主动脉血管壁脂质斑块面积的影响

3.3 银蓝调脂胶囊对ApoE-/-小鼠肝脏TC、TG、LDL-C水平的影响 与正常组比较，模型组小鼠肝脏TC、TG、LDL-C水平升高(P<0.01)；与模型组比较，银蓝调脂胶囊高剂量组小鼠肝脏TC、TG、LDL-C水平均降低(P<0.01)，中、低剂量组小鼠肝脏TC水平降低(P<0.05)，见表4。

3.4 银蓝调脂胶囊对ApoE-/-小鼠肝脏脂质面积的影响 与正常组比较，模型组小鼠肝脏脂质面积增加(P<0.01)；与模型组比较，银蓝调脂胶囊各剂量组肝脏脂质面积均减少(P<0.01)，且高剂量组减少肝脏脂质面积更显著(P<0.01)，见表5。

表4 银蓝调脂胶囊对ApoE-/-小鼠肝脏中TC、TG、LDL-C水平的影响

表5 银蓝调脂胶囊对ApoE-/-小鼠肝脏脂质面积的影响

3.5 银蓝调脂胶囊对ApoE-/-小鼠肝脏中ABCG5、SR-B1、iNOSmRNA表达的影响 与正常组比较，模型组小鼠肝脏ABCG5、SR-B1 mRNA表达降低(P<0.01)，iNOSmRNA表达升高(P<0.01)；与模型组比较，银蓝调脂胶囊各剂量组SR-B1 mRNA表达升高(P<0.01)，iNOSmRNA表达降低 (P<0.01)，其中高剂量组SR-B1 mRNA表达升高更显著，中剂量组ABCG5 mRNA表达升高(P<0.01)，见表6。

3.6 银蓝调脂胶囊对ApoE-/-小鼠LXR信号通路相关蛋白表达的影响

3.6.1 银蓝调脂胶囊对ApoE-/-小鼠肝脏脂质代谢相关蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组小鼠肝脏LXRα、ABCG5、CYP7A1、SREBP-1c蛋白表达降低(P<0.01)；与模型组比较，银蓝调脂胶囊低剂量组小鼠肝脏LXRα、ABCG5、CYP7A1、SREBP-1c蛋白表达均升高(P<0.05)；银蓝调脂胶囊各剂量组两两比较，各蛋白表达均无明显变化(P>0.05)，见表7、图1。

表6 ApoE-/-小鼠肝脏ABCG5、SR-B1、iNOS mRNA表达

3.6.2 银蓝调脂胶囊对ApoE-/-小鼠肝脏炎症反应相关蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组小鼠肝脏iNOS蛋白表达升高(P<0.05)；与模型组比较，银蓝调脂胶囊各剂量组小鼠肝脏iNOS蛋白表达降低(P<0.05，P<0.01)，高、低剂量组小鼠肝脏COX2蛋白表达降低 (P<0.05，P<0.01)，且低剂量组肝脏COX2蛋白表达降低更显著，见表8、图2。

4 讨论

动脉粥样硬化即体内脂质代谢紊乱导致血管壁上脂质堆积引起动脉壁狭窄的疾病[6]。临床研究表明，血清ox-LDL升高及主动脉斑块增加是判断动脉粥样硬化的指标[7]。如今抑制胆固醇合成不再是治疗动脉粥样硬化的唯一方法，促进胆固醇逆向转运已成为治疗的新思路。胆固醇逆向转运是通过高密度脂蛋白将周围组织中过量的胆固醇转移到肝脏进行胆汁酸合成和排泄的过程，在动脉粥样硬化的发生发展中具有关键作用[8]。外周组织胆固醇流出是其中一种途径，即外周组织细胞内胆固醇通过ABCA1释放到细胞外，经卵磷脂胆固醇酰基转移酶酯化为胆固醇酯后，与肝脏B族Ⅰ型清道夫受体(scavenger receptor class B type 1, SR-B1)受体结合，进入肝脏[9]。胆固醇酯通过ABCG5/ABCG8异二聚体向胆汁中转移，再经过CYP7A1代谢为胆汁酸排出体外[10]。肝脏是代谢脂质的主要场所，当肝脏发生炎症时，其脂质代谢能力则会下降，会促进动脉粥样硬化的进展。其中环氧化酶2(cyclooxygenase 2, COX2)和iNOS是肝炎的重要指标，当两种炎症因子表达增多，提示肝脏出现炎症[11]。

表7 ApoE-/-小鼠肝脏LXRα、ABCG5、CYP7A1、SREBP-1c蛋白表达

表8 ApoE-/-小鼠肝脏iNOS、COX2蛋白表达

图1 各组小鼠肝脏LXRα、ABCG5、CYP7A1、SREBP-1c蛋白印迹条带

图2 各组小鼠肝脏iNOS、COX2蛋白印迹条带

LXRs是胆固醇逆向转运途径中关键的固醇敏感转录因子，具有调节胆固醇水平并维持其稳态的重要作用[12]。LXRs具有2种亚型，分别为LXRα和LXRβ。LXRα主要在代谢活跃的组织和细胞中高表达，如肝、肠、脂肪组织和巨噬细胞。LXRβ则在全身组织细胞广泛表达[13]。邵丹阳[14]发现，当LXRs被激活后，与脂质代谢相关的蛋白如ATP结合盒转运家族、载脂蛋白、CYP7A1、SR-B1以及SREBP-1c表达均增加，显著改善血脂水平。除了具备维持胆固醇稳态的功能，近年来，已有文献报导LXRs也有抑制炎症因子合成的作用，激活LXRα可有效避免肝脏纤维化等疾病[15]，He等[16]发现激活LXR可以抑制iNOS以及COX2的表达，对炎症具有抑制作用。

本次实验中发现，ApoE-/-模型组小鼠血清中ox-LDL水平升高，胸主动脉斑块面积增加，肝脏脂质水平上升；银蓝调脂胶囊进行干预之后，小鼠血清ox-LDL水平降低，且胸主动脉斑块面积减少，说明银蓝调脂胶囊具有较好的抗动脉粥样硬化作用；另发现，银蓝调脂胶囊能够较好地降低肝脏中TC、TG、LDL-C水平，提示银蓝调脂胶囊的抗动脉粥样硬化作用可能与提高肝脏脂质代谢能力相关。分子机制研究表明，银蓝调脂胶囊提高LXRα、ABCG5、CYP7A1、SR-B1、SREBP-1c的表达，提示LXR通路被激活，与促进胆固醇逆向转运途径相关基因或蛋白的表达上调，从而使胆固醇从胸主动脉的斑块向肝脏转移并被代谢出体外有关。与此同时，肝脏中iNOS以及COX2等促炎因子的基因和蛋白表达下降，说明银蓝调脂胶囊可能通过激活LXRs而抑制炎症因子的表达，从而发挥抗炎作用。

综上所述，银蓝调脂胶囊治疗动脉粥样硬化的机制可能与激活LXR信号通路，促进ABCG1、SR-B1、CYP7A1表达，加强胆固醇逆向转运，促进外周组织即血管壁斑块处的胆固醇流向肝脏进行代谢，降低血管壁斑块及肝脏脂质水平有关。与此同时，银蓝调脂胶囊亦能够抑制iNOS、COX2的表达从而缓解肝脏炎症反应，提高其脂质代谢能力相关。