柏子仁制霜工艺优化及脂肪油测定

王 琼， 刘 敬*， 曹 晖

(1.中山火炬职业技术学院健康产业学院，广东 中山 528436；2.国家中药现代化工程技术研究中心，广东 珠海 519085)

柏子仁为柏科植物侧柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥成熟种仁，味甘性平，归心、肾、大肠经，具有养心安神、润肠通便、止汗的功效。柏子仁霜在2020年版《中国药典》一部[1]、1988年版《全国中药炮制规范》[2]及部分省地方规范[3]中均有收载，其最早见于宋代《博济方》[4]，炮制目的在于减少脂肪油含量，消除致呕、致泻副作用[5]。目前，有学者采用干燥箱制霜法[6]、CO2超临界制霜法[7]等对柏子仁制霜方法进行研究，并对不同制霜炮制方法进行了比较[8]，但尚未见柏子仁霜压榨制霜工艺的研究报道。本研究采用正交试验对柏子仁压榨去油制霜工艺中的炮制压力、炮制温度、炮制次数、炮制时间等参数进行优化，并采用气相色谱法(GC)对柏子仁和柏子仁霜所含脂肪油中成分进行分析，可为制定相关炮制规范提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 制霜板(实验室自制)；800Y型多功能粉碎机(永康市铂欧五金制品有限公司)；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；BS124S型分析天平(德国Sartorius公司)；SB-5200DTD型超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；TU-1810型紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；GC-2010 PLUS型气相色谱仪(日本岛津公司)。

1.2 饮片 柏子仁由国家中药现代化工程技术研究中心提供，批号20170401，经中山火炬职业技术学院赵斌博士鉴定为柏科植物侧柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥成熟果实,碾去果壳及种皮，取种仁备用。

1.3 试剂与药物 烘焙专用吸油纸(厚0.1 mm，执行标准GB4806.8-2016，广州金洁沣纸业有限公司)。齐墩果酸对照品(批号PS013402，成都普思生物科技股份有限公司，纯度>98.0%)；40种脂肪酸甲酯对照品(批号JA4-A，美国Nu-Chek公司，纯度99.0%)。正庚烷为色谱纯；氢氧化钠、三氟化硼、氯化钠、香兰素、冰醋酸、浓硫酸、乙醇、甲醇、石油醚(60～90 ℃)等为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 总皂苷含量测定 采用香草醛-浓硫酸显色法[9]测定。

2.1.1 对照品溶液制备 精密称取齐墩果酸对照品适量，甲醇制成每1 mL约含100 μg该成分的溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液制备 精密称取柏子仁霜2.0 g，装入滤纸筒置索氏提取器中，加石油醚(60～90 ℃)200 mL回流提取2 h，弃去提取液，取出，药渣连同滤纸筒挥干溶剂后移入具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 70%乙醇，称定质量，超声(40 kHz、250 W)提取30 min，冷却，70%乙醇溶液补足减失的质量，倾出提取液，精密吸取提取液25 mL，蒸干，残渣加20 mL水，转入分液漏斗中，加正丁醇提取3次，每次10 mL，合并正丁醇液并蒸干，适量甲醇溶解残渣，转移至10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 线性关系考察 精密量取“2.1.1”项下对照品溶液(0.116 5 mg/mL)0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于试管中，挥干溶剂，精密加入1 mL新鲜5%香兰素冰醋酸、5 mL 80%硫酸，摇匀，85 ℃水浴加热10 min，取出，冰水浴中冷却15 min，取出，放置至室温，以相应试剂为空白，在538 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标(A)，对照品质量浓度为横坐标(X)进行回归，得方程为A=8.004 1X+0.039 7(r=0.999 5)，在0.116 5～0.023 3 mg/mL范围内线性关系良好。

2.1.4 精密度试验 取“2.1.3”项下对照品溶液，于538 nm波长处测定吸光度6次，测得其RSD为0.08%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 取“2.1.3”项下对照品溶液，于0、20、40、60、80、100、120 min测定吸光度，测得其RSD为1.04%，表明溶液在120 min内稳定性良好。

2.1.6 重复性试验 称取同一批柏子仁霜6份，每份2.0 g，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，精密量取1.0 mL，置于10 mL具塞试管中，按“2.1.3”项下方法测定吸光度，测得其RSD为0.86%，表明该方法重复性良好。

2.1.7 加样回收率试验 精密称取同一批柏子仁霜6份，每份1.0 g，精密加入对照品溶液(2.913 mg/mL)1.0 mL，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，精密量取1.0 mL，置于10 mL具塞试管中，按“2.1.3”项下方法测定吸光度，计算回收率。结果，齐墩果酸平均加样回收率为96.33%，RSD为1.71%。

2.2 制霜工艺优化

2.2.1 正交试验设计 在预试验基础上，以炮制温度(A)、炮制压力(B)、炮制次数(C)、炮制时间(D)为影响因素，每个因素3个水平，L9(34)正交试验优化炮制工艺，因素水平见表1。

2.2.2 饮片炮制 取净柏子仁适量，碾成粗粉后分为9份，每份20 g，将吸油纸平铺于制霜板上，粗粉均匀平铺于吸油纸上，上层再覆盖吸油纸，之后盖上另一块制霜板(首次试验上下各用6张吸油纸，后续试验各用3张)，调节螺母，使上下两块制霜板之间的压力达到表1中的炮制压力，置于规定温度的烘箱中，达到规定时间后取出，打开制霜板，取出粗粉，完成1次压制，同法操作至规定次数，取出，放凉，粉碎，收集过80目筛的细粉，即得柏子仁霜。

表1 因素水平

2.2.3 脂肪油提取 精密称取粗粉1 g，置于索氏提取器中，加乙醚适量，回流提取8 h至脂肪油提尽，收集提取液，置于干燥至恒重的蒸发皿中，水浴低温蒸干，在100 ℃下干燥1 h，移到干燥器中冷却30 min，精密称定质量。

2.2.4 数据处理 采用Hassan法对脂肪油、总皂苷含量进行归一化处理[10]，前者取值越小越好，后者取值越大越好，计算公式为dmin=(Ymax-Yi)/(Ymax-Ymin)、dmax=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)，其中Ymin为指标中最小值，Ymax为指标中最大值，总评“归一值”(OD值)=(d1·d2)1/2，结果见表2，方差分析见表3。

表2 试验设计与结果

表3 方差分析

2.2.5 最优工艺的确定 表3显示，各因素影响程度依次为炮制压力(B)>炮制温度(A)>炮制次数(C)>炮制时间(D)，其中因素B有显著影响(P<0.05)，最优工艺为A1B3C1D1。具体为取净柏子仁粗粉适量，吸油纸(上下各用6张)下垫上盖，调节螺母使2块制霜板之间的压力达到120 kPa，于烘箱中恒温40 ℃，静置60 min后取出，重复2次(上下各用3张吸油纸)，取出柏子仁粗粉，放凉，粉碎，收集过80目筛的细粉，即得柏子仁霜。

2.3 验证试验 按“2.2.5”项下优化工艺制备3批柏子仁霜(命名为柏子仁霜1～柏子仁霜3)，均为粒度均匀、疏松的淡黄色粉末，显油性，见图1，总皂苷、脂肪油平均含量分别为0.32%、13.6%，证明该工艺稳定可行，重复性好。

图1 柏子仁炮制前后图

2.4 脂肪油含量测定 参照国标GB5009.168—2016(《食品中脂肪酸的测定品中氨基酸的测定》)[11]测定。

2.4.1 供试品溶液制备 按“2.2.3”项下方法提取脂肪油，取100 mg至烧瓶中，加入2%氢氧化钠甲醇溶液8 mL，(80±1)℃水浴回流至油滴消失，从冷凝管上端加入7 mL 15%三氟化硼甲醇溶液，(80±1)℃水浴继续回流2 min，停止加热，用冷水冲洗冷凝管，取下烧瓶，快速冷却，精密量取20 mL正庚烷至烧瓶中，摇动2 min左右，再加入适量饱和氯化钠水溶液，分层后吸取约5 mL正庚烷溶液至试管中，加入3～5 g无水硫酸钠，振摇1 min后静置5 min，吸取上层溶液，即得。

2.4.2 色谱条件 HP-88色谱柱(100 m×0.25 mm，0.2 μm)；进样口温度240 ℃；检测器温度250 ℃；程序升温(130 ℃保持1 min，10 ℃/min升至180 ℃，2.75 ℃/min升至215 ℃，5 ℃/min升至235 ℃，保持10 min)；体积流量1.2 mL/min；分流比5∶1。

2.4.3 结果分析 精密吸取“2.4.1”项下供试品溶液1.0 μL，在“2.4.2”项色谱条件下进样测定，与混合脂肪酸甲酯对照品图谱进行比对以确定脂肪酸归属，按“2.2.4”项下方法测定脂肪酸含量，结果见图2、表4。由此可知，生品、炮制品中均检出10种脂肪酸，其种类无明显变化，相对含量基本一致，即未受制霜工艺影响，其中油酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯总含量约占85%，其次是棕榈酸甲酯、硬脂酯酸甲酯，两者总含量约占10%。

1. 棕榈酸甲酯 2. 珠光脂酸甲酯 3. 硬脂酯酸甲酯 4. 油酸甲酯 5. 亚油酸甲酯 6. 亚麻酸甲酯 7. 花生烯酸甲酯8. 二十一烷酸甲酯 9. (11Z,14Z)-11,14-二十碳二烯酸甲酯 10. 芥酸甲酯图2 各成分GC色谱图

3 讨论

目前柏子仁霜的法定炮制方法是压榨去油制霜法，该方法也是柏子仁传统炮制方法。本研究通过测定柏子仁中脂肪油和总皂苷的含量，采用正交试验，优化了炮制温度、炮制压力、炮制次数和炮制时间等重要的制霜工艺参数，确定了最佳工艺，不仅符合柏子仁霜炮制规范，还为制定柏子仁霜饮片生产规范奠定了基础。

表4 脂肪酸含量测定结果(%，n=2)

柏子仁制霜的目的在于消除致呕和致泻的副作用[12]，多用于虚烦失眠的脾虚患者。孙付军等[13]研究发现，0～16%含油量的柏子仁对小鼠便秘模型的相关指标均无明显影响，提示柏子仁霜的含油量控制在16%以下就不会产生致泻的副作用。另有研究表明柏子仁油能一定程度增加小鼠睡眠指数，柏子仁总皂苷能明显延长小鼠睡眠时间，提示柏子仁制成霜以后，安神作用较强的皂苷成分含量增加，引起致泻的脂肪油含量降低，符合古人对柏子仁制霜的目的[14]。

采用压榨去油制霜法制备的柏子仁霜，脂肪油含量保持在13.6%左右，脂肪油成分在制霜过程中未受到破坏，各成分组成及其相对含量与生柏子仁均基本一致[15]，符合柏子仁制霜炮制的要求。