无花果粗多糖脱色工艺优化及其吸附性能研究

曾 杰， 房海灵*， 梁呈元*， 亓希武， 郭 强

(1.江苏省中国科学院植物研究所，江苏 南京 210014；2.句容市虎耳山无花果专业合作社，江苏 镇江 212013)

无花果FicuscaricaL.为桑科榕属多年生落叶灌木，因花隐藏于花托内，只见果不见花而得名[1]，是人类最早驯化栽培的果树之一，具有抗氧化、抑菌、抗癌、降血糖血脂功效，可治疗胃癌、表皮癌、肝癌、糖尿病、高血脂症等，是一种极具开发潜力的药食同源型水果[2-4]，多糖是其主要活性成分之一[5]。目前，常用的多糖提取方法为水提醇沉法，但含有色素、蛋白质等杂质，严重影响了其功效[6]。为了更好地对无花果多糖进行开发应用，有必要寻找一种适合的纯化方法对其进行脱色。

目前，常用的多糖脱色方法有活性炭法、过氧化氢法、大孔树脂吸附法，其中活性炭法耗时长，活性炭难以去除[7]；过氧化氢法氧化强度过高，会导致多糖结构破坏[8]；大孔树脂吸附法利用树脂与被吸附分子之间范德华引力的强弱而达到多糖纯化目的，具有操作简便、吸附效果好、不改变多糖性质等优点，被广泛应用于多糖脱色工艺[9]。因此，本实验在筛选大孔树脂类型的基础上，采用单因素试验结合响应面法优化影响无花果粗多糖中色素吸附效果的因素，并考察树脂解吸附性质，分析其再生功能，以期为该成分的进一步开发利用提供技术支撑。

1 材料

1.1 药材 无花果为采自句容市虎耳山无花果专业合作社的“玛斯义陶芬”成熟果实，经江苏省中国科学院植物研究所刘启新研究员鉴定为桑科榕属植物无花果FicuscaricaL.的果实，洗净自然晾干后切成0.5 cm厚片，-50 ℃真空冷冻干燥机中干燥，粉碎后过40目筛备用。

1.2 试剂与药物 D941、XDA-1、AB-8、D3520、D301型大孔吸附树脂(北京中冉旭升科技发展有限公司)。硫酸、苯酚、乙醇等均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 仪器 Lab-1A-50E真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；SpectraMax Plus 384连续光谱扫描式酶标仪(美国Molecular Devices公司)；Rotavapor R-210旋转蒸发仪(瑞士Buchi Labortechnik AG公司)。

2 方法

2.1 粗多糖制备 药材粉末按料液比1∶60加水混匀，70 ℃下超声提取25 min，滤过，弃滤渣，滤液低温浓缩至原体积的1/4，加4倍量95%乙醇静置过夜，4 500 r/min离心15 min，用适量无水乙醇清洗沉淀2次，-50 ℃下冷冻干燥，即得。

2.2 大孔吸附树脂筛选 取冷冻干燥后粗多糖，精密称定质量后，加去离子水溶解，摇匀，制得质量浓度为5 mg/mL的溶液。精密称取经预处理的5种大孔吸附树脂各4 g，置于100 mL具塞三角瓶中，加入50 mL上述溶液，调节pH至6.4，30 ℃恒温摇床中150 r/min匀速振荡120 min，4 000 r/min离心10 min，收集上清液，测定脱色率、多糖保留率，其中多糖含量采用苯酚-硫酸法测定[9]，保留率Y1计算公式为Y1=(C2/C1)×100%(C1、C2分别为脱色前、脱色后多糖含量)。将样品于300～650 nm波长范围内完成扫描，发现吸收峰在450 nm左右，故选择其作为检测波长，同时对不同pH粗多糖溶液进行扫描，发现pH仅对吸光度有影响，而对最大吸收波长几乎无影响，脱色率Y2计算公式为Y2=[(A1-A2)/A1]×100%[9](A1、A2分别为脱色前、脱色后溶液吸光度)。综合指标=(多糖脱色率+多糖保留率)/2。

2.3 静态吸附动力学研究 精密称取大孔吸附树脂4 g至100 mL具塞三角瓶中，加入50 mL“2.2”项下粗多糖溶液，调节pH至6.4，在30 ℃恒温摇床中150 r/min匀速振荡，每隔一定时间取样，测定多糖保留率和脱色率，绘制吸附动力学曲线。

2.4 静态吸附参数优化

2.4.1 单因素试验 (1)在粗多糖溶液质量浓度(上样质量浓度)5 mg/mL、pH 6.4、脱色时间2 h，脱色温度30 ℃的条件下，设定树脂用量分别为2、4、6、8、10、12 g/mL；(2)在树脂用量4 g/mL、pH 6.4、脱色时间2 h、脱色温度30 ℃的条件下，设定上样质量浓度分别为2.5、5、10、15、20、25、30 mg/mL；(3)在树脂用量4 g/mL、上样质量浓度5 mg/mL、脱色时间2 h、脱色温度30 ℃的条件下，设定pH分别为3、4、5、6、7、8；(4)在树脂用量4 g/mL、上样质量浓度5 mg/mL、pH 6.4、脱色温度30 ℃的条件下，设定脱色时间分别为1、2、3、4、5、6 h；(5)在树脂用量4 g/mL、上样质量浓度5 mg/mL、pH 6.4、脱色时间2 h的条件下，设定脱色温度分别为10、20、30、40、50、60 ℃。

2.4.2 响应面法 在单因素试验基础上，通过Design-Expert 8.0.6软件进行响应面设计，因素水平见表1。

表1 因素水平

2.4.3 静态解吸附实验 称取相同质量树脂6份，置于三角瓶中，加入相同体积和质量浓度的粗多糖溶液，在pH 4.2、吸附温度32 ℃的条件下恒温振荡5 h至吸附平衡，滤过，超纯水清洗树脂后吸干水分，加入相同体积0、20%、40%、60%、80%、95%乙醇，恒温下振荡10 h，测定多糖、色素含量，计算解吸率[10]。

2.5 统计学分析 通过Design expert 8.0.6、GraphPad Prism v6.02软件进行处理。

3 结果

3.1 大孔吸附树脂筛选 大孔吸附树脂的吸附性能受树脂组成、极性、空间结构(孔径、比表面积)、被吸附分子极性和大小等因素影响[11]，故选择适宜树脂对无花果粗多糖脱色至关重要。表2显示，D301型树脂对无花果粗多糖的脱色效果及多糖保留率优于其他树脂，这是因为无花果粗多糖中色素大多为具有酚羟基的化合物，生成氢键的能力较强，易于与D941、AB-8、D301等弱极性树脂产生较强的吸附作用；XDA-1、D3520等非极性树脂则对色素吸附能力较低；较高比表面积也有利于树脂吸附，3种弱极性树脂中以D301树脂的比表面积相对较大，色素吸附量也更高。因此，本实验选择D301树脂用于无花果粗多糖的色素去除。

表2 5种大孔吸附树脂对粗多糖色素的吸附效果

3.2 静态吸附动力学 图1显示，吸附时间在0～100 min时，脱色率随着时间延长而呈快速升高的趋势，表明色素吸附量迅速增加；在100～125 min时，色素吸附量呈缓慢上升阶段；125 min后D301树脂对色素的吸附、解吸附达到动态平衡。因此，选择125 min作为最优吸附时间。

图1 D301树脂静态吸附动力学曲线(n=3)

3.3 静态吸附参数

3.3.1 树脂用量对粗多糖脱色效果的影响 图2显示，树脂用量为2 g时，由于色素、多糖含量超出树脂吸附能力，故仍存在多余的两者未被吸附，导致脱色率低、多糖保留率高；随着树脂用量增加，色素脱除率先升高后保持稳定，而多糖保留率降低，其原因可能是随着树脂量升高，其吸附量大于扩散出来的色素分子，脱色率达到饱和，同时被树脂吸附的多糖也随之增加。因此，选择4 g/50 mL作为树脂用量进行后续优化。

注：不同小写字母表示同一参数在不同因素水平有差异，P<0.05。图2 树脂用量对粗多糖脱色效果的影响(n=3)

3.3.2 上样质量浓度对粗多糖脱色效果的影响 图3显示，上样质量浓度为5～35 mg/mL时，脱色率急剧降低，保留率则变化不显著。因此，选择5 mg/mL作为上样质量浓度进行后续优化。

注：不同小写字母表示同一参数在不同因素水平有差异，P<0.05。图3 上样质量浓度对粗多糖脱色效果的影响(n=3)

3.3.3 pH对粗多糖脱色效果的影响 图4显示，随着pH的升高，脱色率先升高后降低，在3～5时最高；保留率亦然，在4时最高。因此，选择pH 4进行后续优化。

注：不同小写字母表示同一参数在不同因素水平有差异，P<0.05。图4 pH对粗多糖脱色效果的影响(n=3)

3.3.4 脱色时间对粗多糖脱色效果的影响 图5显示，随着脱色时间延长，脱色率先升高后趋于平缓，在2～3 h时最高，保留率则先升高后降低。因此，选择2 h作为脱色时间进行后续优化。

注：不同小写字母表示同一参数在不同因素水平有差异，P<0.05。图5 脱色时间对粗多糖脱色效果的影响(n=3)

3.3.5 脱色温度对粗多糖脱色效果的影响 图6显示，随着温度升高，脱色率先升高后降低，在30 ℃时最高；大于30 ℃后，树脂对色素的解析速度大于吸附速度，导致脱色率大幅降低，同时多糖分子易发生结构变化，使得保留率也降低。因此，选择30 ℃作为脱色温度进行后续优化。

注：不同小写字母表示同一参数在不同因素水平有差异，P<0.05。图6 脱色温度对粗多糖脱色效果的影响(n=3)

3.3.6 响应面法 在单因素试验基础上，选择pH(A)、上样质量浓度(B)、脱色时间(C)、脱色温度(D)作为影响因素，脱色率作为评价指标(Y)，通过Design expert 8.0.6软件进行响应面设计，结果见表3。

对表3数据进行多元回归分析，得方程为Y=85.74+2.30A+1.17B+0.13C-4.78D+0.47AB+0.50AC+0.23AD-0.18BC+0.55BD+0.42CD-5.25A2-2.16B2-1.74C2-10.22D2，方差分析见表4。由此可知，模型P<0.01，表明其极显著；失拟项P>0.05，表明模型成功建立；模型R2=0.987 8，表明其拟合程度较好；A、B、C、A2、B2、C2、D2有显著影响(P<0.05)。最终确定，最优脱色工艺为pH 4.23，脱色温度32.2 ℃，树脂用量4 g/50 mL，上样质量浓度5.52 mg/mL，脱色时间2.03 h，脱色率86.69%。

表3 试验设计与结果

响应面分析见图7。由此可知，与因素B方向比较，A效应面曲线较陡，表明pH对脱色率的影响高于上样质量浓度：与C方向比较，A效应面曲线较陡，表明pH对脱色率的影响高于脱色时间；与A方向比较，D效应曲线较陡，等高线密度高于沿pH移动的密度，表明脱色温度对脱色率的影响高于pH；与C方向比较，B效应面曲线略陡，表明上样质量浓度对脱色率的影响高于脱色时间；与B方向比较，D效应曲线较陡，等高线密度高于沿上样浓度移动的密度，表明脱色温度对脱色率的影响高于上样质量浓度；与C方向比较，D效应曲线较陡，等高线密度高于沿上样浓度移动的密度，表明脱色温度对脱色率的影响高于脱色时间。综上所述，各因素影响程度依次为D>A>B>C。

3.4 验证试验 考虑到实际可操作性，将“2.3.6”项下优化工艺略作修改，即pH 4.2，脱色温度32 ℃，树脂用量4 g/50 mL，上样质量浓度5.5 mg/mL，脱色时间2 h，并进行验证试验。结果，脱除率为86.18%，与预测值86.69%仅相差0.59%，并且多糖保留率为88.41%，表明模型拟合度良好。

表4 方差分析

3.5 树脂解吸附及再生 树脂通过范德华引力与物质吸附，相反地，改变树脂与被吸附物质之间的吸附力可使被吸附物质脱附，进而实现树脂再生和重复利用[10]，目前常用洗脱剂有甲醇、乙醇、丙酮等，从食品安全角度出发，本实验选择了乙醇，并考察其对D301树脂再生效果的影响，结果见图8。由此可知，随着乙醇体积分数增加，树脂对色素、多糖的解吸能力逐渐加强，在40%时解吸率达60%以上，在60%～95%时大大减弱了两者与树脂之间的引力，使其从中释放出来，解吸率均在90%以上。从节约成本角度考虑，以60%乙醇为解吸液即可实现树脂再生和循环利用。

图7 各因素响应面图

注：不同小写字母表示同一参数在不同乙醇体积分数处理时有差异，即P<0.05。图8 不同体积分数乙醇对D301树脂解吸附性能影响

4 讨论

不同类型大孔吸附树脂因组成、空间结构、被吸附分子性质的不同，吸附效果也有所差异，例如菊苣多糖选择D301G型树脂脱色效果最好[12]，而草莓多糖以NKA-9型树脂脱色效果最佳[13]。无花果粗多糖色素大多为具有酚羟基成分，生成氢键能力较强，易于与弱极性树脂结合，故选择弱极性D301树脂进行吸附。

树脂用量、上样液质量浓度的筛选可最大程度利用树脂吸附能力，有利于生产成本节约。本实验树脂用量起初过低，导致色素和多糖分子超出树脂吸附能力；随着其用量升高，吸附量大于扩散出的色素分子，脱色率达到饱和，同时被吸附的多糖分子也增加，表现为脱色率高、多糖保留率低。另外，上样液质量浓度可通过影响多糖黏度来改变多糖和色素分子的扩散能力，另外还决定了大孔树脂功能基团结合的两者数目，其质量浓度过低虽然有利于色素吸附，但同时树脂剩余功能基团会对多糖分子进行吸附，造成该成分损失。

pH可通过影响多糖和色素分子的结构来影响其与树脂的吸附能力。本实验发现，pH在3～5时D301树脂对脱色效果最佳，可能是无花果粗多糖色素在弱酸性条件下表现为弱极性或非极性，易于被弱极性树脂D301吸附；在碱性环境下，部分色素分子性质发生改变或多糖中部分还原糖发生美拉德反应，导致颜色加深、脱色率降低。

色素分子的扩散与被吸附需要一定的时间。本研究发现，吸附时间1 h时脱色率仅为73%，而延长至2 h时可达84%，可能是短时间内色素分子未被充分吸附，而达到一定时间后树脂对色素的吸附和解吸达到平衡，但继续延长后变化不大；多糖分子因时间延长出现死吸附现象，导致保留率略有下降。

温度可通过改变多糖和色素分子扩散能力、树脂吸附位点来影响吸附效果，刘海霞等[14]报道，20 ℃下LSA-800B树脂对大枣多糖色素的吸附效果最佳。本实验发现，30 ℃时D301树脂对脱色效果最好，这是因为温度过高加速了分子扩散能力，促进了色素分子与树脂的吸附，但树脂对色素的吸附是放热过程，温度过高会导致色素解吸速度大于吸附速度，进而引起脱色率大幅降低[15]。

响应面法利用多元二次方程拟合因素与响应值之间的函数关系来求取最优工艺参数，考察因素范围全面，所得工艺参数可靠。本实验结合单因素试验和该方优化D301树脂对无花果粗多糖色素脱除的影响因素，发现优化工艺下脱色率为86.18%，与预测值相对误差较小，验证了其可靠性和准确性。