福建省稻瘟病菌对4种杀菌剂的敏感性分析

阮宏椿，石妞妞，田佩玉,，杜宜新，陈文乐，陈巧红，陈凤平，陈福如

(1福建省农业科学院 植物保护研究所/福建省作物有害生物监测与治理重点实验室，福建 福州 350013；2福建农林大学 植物病理学系，福建 福州350002；3三明市植保植检站，福建 三明365000)

由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的稻瘟病是水稻最严重的病害之一，常年发生且广泛分布于水稻种植地区，一旦发生可减产10%～20%，严重时减产可达40%～50%[1-2]。我国稻瘟病年发生面积在380万hm2以上，减产达10亿kg，对水稻生产造成很大损失[3]。目前，化学防治仍然是水稻稻瘟病的主要防治措施，常用杀菌剂包括甲氧基丙烯酸酯类(QoIs)，如吡唑醚菌酯[4-5]；黑色素合成抑制剂类(MBIs)，如三环唑[6]；14α-脱甲基酶抑制剂类(DMIs)，如丙环唑、戊唑醇[7-9]；苯并咪唑类(MBCs)，如多菌灵[10-11]等。

吡唑醚菌酯是QoIs类杀菌剂，广泛应用在各种农作物和果树上，已经成为全球销量最高的杀菌剂之一[12]，其杀菌谱广，对丝核菌属[13]、曲霉属[14]、镰刀菌属[15]等引发的病害均有良好防效。研究表明，吡唑醚菌酯对稻瘟病具有明显的保护和治疗作用[4-5]，其微囊悬浮剂的研发成功解决了对水生生物毒性高的问题，已登记用于水稻病害防治[16-17]。吡唑醚菌酯对稻瘟病菌具有很高的毒力活性[4,18]，但因其作用位点单一，容易产生抗药性，已报道芒果蒂腐病菌(Botryodiplodiatheobromae)[19]、草莓灰霉病菌(Botrytiscinerea)[20]等病原菌对吡唑醚菌酯产生了较高的抗药性。戊唑醇和丙环唑是DMIs类杀菌剂，其杀菌谱广，单剂或复配剂能有效防治稻瘟病、稻曲病、纹枯病等多种水稻病害[7-10]。研究表明，戊唑醇和丙环唑对稻瘟菌具有较好毒力活性[7,21]，但长期使用已导致油茶炭疽病菌(Colletotrichumfructicola)[22]、草坪币斑病菌(Sclerotiniahomoeocarpa)[23]等病原菌产生抗药性。多菌灵属于MBCs类杀菌剂，常用来防治稻瘟病、恶苗病、纹枯病等多种水稻病害[10-11,24]。随着多菌灵的大量使用，其抗药性问题已经比较严重[25-26]。水稻稻瘟病在福建省常年发生，防治稻瘟病的施药频率较高。目前关于福建省稻瘟病菌对吡唑醚菌酯、戊唑醇、丙环唑和多菌灵的敏感性尚不清楚。为此，本研究采用菌丝生长速率法[27]测定了稻瘟病菌对吡唑醚菌酯、戊唑醇、丙环唑和多菌灵的敏感性，并分析稻瘟病菌对4种杀菌剂敏感性的相关性，旨在为稻瘟病菌的抗药性监测及防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 2017-2019年从福建将乐、沙县、宁化、建阳、南靖、上杭水稻品种抗性鉴定圃未施用过吡唑醚菌酯的田块采集水稻穗颈瘟标本，采用单孢分离法进行病原菌分离，根据形态学进行病原菌鉴定和致病性测定，获得稻瘟病菌116株，4 ℃斜面保存备用。

1.1.2 供试培养基 可溶性淀粉培养基：可溶性淀粉10 g、酵母膏2 g、CaCO33 g、琼脂粉15 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.5。

1.1.3 供试药剂 98%吡唑醚菌酯(pyrazoxystrobin)、96%多菌灵(carbendazim)，江苏辉丰生物农业股份有限公司生产；98%戊唑醇(tebuconazole)，江苏丰登农药有限公司生产；98%丙环唑(propiconazole)，沈阳化工研究院生产。将吡唑醚菌酯、戊唑醇、丙环唑用二甲基亚砜溶解，多菌灵用0.10 mol/L盐酸溶解，以上杀菌剂均配成质量浓度为1×104μg/mL母液，存放于4 ℃冰箱保存备用。99%水杨肟酸(Salicylohydroxamic，SHAM)，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司生产，将其用二甲基亚砜溶解，配成质量浓度为1×105μg/mL母液，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 稻瘟病菌对4种杀菌剂的敏感性测定 采用菌丝生长速率法[27]，测定分离获得的116株稻瘟病菌对4种杀菌剂的敏感性。将供试菌株接种到可溶性淀粉培养基上进行活化，28 ℃培养7 d，用直径5 mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，将菌饼菌丝面朝下接种到含有不同质量浓度杀菌剂的可溶性淀粉平板上，其中吡唑醚菌酯质量浓度为0.000 1，0.000 5，0.001，0.005和0.01 μg/mL，为防止旁路氧化，培养基中均含有质量浓度100 μg/mL水杨肟酸[19,28]；戊唑醇质量浓度为0.20，0.40，0.60，0.80和1.00 μg/mL；丙环唑质量浓度为0.05，0.10，0.50，1.00和5.00 μg/mL；以加入等体积二甲基亚砜的平板作为对照。多菌灵质量浓度为0.05，0.08，0.10，0.60和1.00 μg/mL，以加入等体积0.10 mol/L盐酸的平板作为对照。将接菌后的平板置于28 ℃黑暗培养7 d，之后采用十字交叉法测量各处理的菌落直径，每处理重复3次。

计算杀菌剂各质量浓度处理下菌丝生长的抑制率[29]。抑制率=(对照菌落直径-杀菌剂菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100%。以杀菌剂质量浓度的常用对数值为横坐标(x)，菌丝生长抑制率的几率值为纵坐标(y)，进行回归分析，求出4种杀菌剂对各供试菌株的有效抑制中浓度(EC50)值。比较分析福建省6个地区水稻稻瘟病菌群体对吡唑醚菌酯、戊唑醇、丙环唑和多菌灵的敏感性差异，计算不同地区菌株个体间的变异系数[30-31]。变异系数=EC50最大值/EC50最小值。

1.2.2 稻瘟病菌对4种杀菌剂敏感基线的建立 将各杀菌剂对供试稻瘟病菌的EC50值等分成几个区间，通过统计每个区间的菌株数和频率，利用等差间距法建立稻瘟病菌对其的敏感性频率分布图，采用Shapiro-Wilk法进行供试菌株对各杀菌剂敏感性频率分布的正态性检验，若符合正态分布，将该杀菌剂对供试菌株的EC50平均值，作为福建省稻瘟病菌对该杀菌剂的敏感基线[32-33]。

1.2.3 吡唑醚菌酯与戊唑醇、丙环唑和多菌灵对稻瘟病菌毒力的相关性 采用菌丝生长速率法，根据吡唑醚菌酯对稻瘟病菌的EC50，从116株病菌中选取具有代表性的30株病菌，其中EC50最大一端的菌株15株， EC50最小一端的菌株15株，测定其对戊唑醇、丙环唑和多菌灵的敏感性。将吡唑醚菌酯对菌株EC50的常用对数值作为x轴，戊唑醇、丙环唑和多菌灵对菌株EC50的常用对数值作为y轴，进行线性回归分析，得到线性回归方程y=bx+a，根据决定系数(R2)、b值及F检验的显著水平(P值)，分析吡唑醚菌酯与戊唑醇、丙环唑和多菌灵对稻瘟病菌毒力之间的关系：若P<0.05，F检验在P=0.05水平上差异显著，说明2种杀菌剂间相关性显著；若P>0.05，F检验在P=0.05水平上差异不显著，说明2种杀菌剂间相关性不显著。若b值为正，说明2种杀菌剂间存在正相关性；若b值为负，说明2种杀菌剂间存在负相关性。若R2>0.8，说明2种杀菌剂间有较好的相关性[34]。

1.3 数据分析

利用Microsoft Excel 2011计算抑制菌丝生长的毒力回归方程和EC50，建立稻瘟病菌对供试杀菌剂的敏感性频率分布图；采用Duncan’s新复极差法进行差异显著性分析；采用IBM SPSS V21.0软件进行Shapiro-Wilk正态性检验和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 稻瘟病菌对4种杀菌剂的敏感性

由表1可知，吡唑醚菌酯对116株水稻稻瘟病菌的EC50值为0.001 2～0.012 8 μg/mL，EC50最大值是最小值的10.67倍，EC50平均值为0.004 7 μg/mL；戊唑醇对水稻稻瘟病菌的EC50值为0.209 8～0.632 3 μg/mL，EC50最大值是最小值的3.01倍，EC50平均值为0.361 9 μg/mL；丙环唑对水稻稻瘟病菌的EC50值为0.196 8～2.273 0 μg/mL，EC50最大值是最小值的11.55倍，EC50平均值为 0.812 4 μg/mL；多菌灵对水稻稻瘟病菌的EC50值为0.217 6～0.616 1 μg/mL，EC50最大值是最小值的2.83倍，EC50平均值为 0.427 9 μg/mL。供试4种杀菌剂中，吡唑醚菌酯的EC50平均值最小，其次 为戊唑醇、多菌灵和丙环唑，表明稻瘟病菌对吡唑醚菌酯最敏感，其次为戊唑醇、多菌灵和丙环唑。

表1 福建不同稻区稻瘟病菌对4种杀菌剂的敏感性Table 1 Sensitivity of Magnaporthe oryzae to 4 fungicides in different areas in Fujian

2.2 稻瘟病菌对4种杀菌剂的敏感性差异与敏感基线

2.2.1 吡唑醚菌酯 由表1可知，吡唑醚菌酯对将乐、沙县、宁化、建阳、南靖和上杭6个地区稻瘟病菌菌株EC50平均值分别为0.004 9，0.005 7，0.004 1，0.004 5，0.005 0和0.004 5 μg/mL，敏感性差异为1.39倍；宁化地区稻瘟病菌菌株对吡唑醚菌酯最敏感，沙县地区稻瘟病菌菌株对吡唑醚菌酯最不敏感，二者差异显著；同一地区稻瘟病菌菌株间对吡唑醚菌酯的敏感性存在差异，6个地区菌株间的变异系数为2.85～8.58。

由图1可知，116株稻瘟病菌对吡唑醚菌酯的敏感性频率分布为连续性单峰曲线，未出现敏感性下降的亚群体；Shapiro-Wilk正态性检验结果显示，当显著性水平为95%时，偏度(skew)=1.197，峰度(kurt)=2.538，W=0.934，P=0.000(P<0.05)，符合连续的偏正态分布。因此，可将EC50平均值0.004 7 μg/mL作为福建省稻瘟病菌对吡唑醚菌酯的敏感基线。

2.2.2 戊唑醇 由表1可知，戊唑醇对将乐、沙县、宁化、建阳、南靖和上杭6个地区稻瘟病菌菌株EC50平均值分别为0.377 9，0.329 8，0.313 5，0.363 3，0.408 7和0.353 9 μg/mL，敏感性差异为1.30倍；宁化地区稻瘟病菌菌株对戊唑醇最敏感，南靖地区稻瘟病菌菌株对戊唑醇最不敏感，二者差异极显著；同一地区稻瘟病菌菌株间对戊唑醇的敏感性差异较小，6个地区菌株间的变异系数均低于3。

由图2可知，116株稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性频率分布为连续性单峰曲线，未出现敏感性下降的亚群体；Shapiro-Wilk正态性检验结果显示，当显著性水平为95%时，偏度(skew)=0.609，峰度(kurt)=0.097，W=0.968，P=0.007(P<0.05)，符合连续的偏正态分布。因此，可将EC50平均值0.361 9 μg/mL作为福建省稻瘟病菌对戊唑醇的敏感基线。

2.2.3 丙环唑 由表1可知，丙环唑对将乐、沙县、宁化、建阳、南靖和上杭6个地区稻瘟病菌菌株EC50平均值分别为0.710 0，1.079 3，0.750 4，0.775 2，1.004 7和0.736 7 μg/mL，敏感性差异为1.52倍；将乐地区稻瘟病菌菌株对丙环唑最敏感，沙县地区菌株对丙环唑最不敏感，二者差异显著；同一地区稻瘟病菌菌株间对丙环唑的敏感性存在明显差异，6个地区菌株间的变异系数为4.19～7.24。

由图3可知，116株稻瘟病菌对丙环唑的敏感性频率分布为连续性单峰曲线，未出现敏感性下降的亚群体；Shapiro-Wilk正态性检验结果显示，当显著性水平为95%时，偏度(skew)=1.101，峰度(kurt)=1.345，W=0.924，P=0.000(P<0.05)，符合连续的偏正态分布。因此，可将EC50平均值0.812 4 μg/mL作为福建省稻瘟病菌对丙环唑的敏感基线。

2.2.4 多菌灵 由表1可知，多菌灵对将乐、沙县、宁化、建阳、南靖和上杭6个地区稻瘟病菌菌株EC50平均值分别为0.375 0，0.455 1，0.401 5，0.424 3,0.513 1和0.419 1 μg/mL，敏感性差异为1.37倍；将乐地区稻瘟病菌菌株对多菌灵最敏感，南靖地区菌株对多菌灵最不敏感，二者差异极显著；同一地区稻瘟病菌菌株间对多菌灵的敏感性差异较小，6个地区菌株间的变异系数均低于3。

由图4可知，116株稻瘟病菌对多菌灵的敏感性频率分布为连续性单峰曲线，未出现敏感性下降的亚群体；Shapiro-Wilk正态性检验结果显示，当显著性水平为95%时，偏度(skew)=-0.164，峰度(kurt)=0.703，W=0.982，P=0.122(P>0.05)，符合正态分布。因此，可将EC50平均值0.427 9 μg/mL作为福建省稻瘟病菌对多菌灵的敏感基线。

2.3 吡唑醚菌酯与戊唑醇、丙环唑、多菌灵对稻瘟病菌毒力的相关性

图5显示，吡唑醚菌酯与戊唑醇对稻瘟病菌的线性回归方程为y=0.033 7x―0.361 8，P=0.079 4(P>0.05),可知F检验在P=0.05水平上差异不显著；b值为正，但决定系数(R2)为0.006 3，小于0.8，说明稻瘟病菌对吡唑醚菌酯与其对戊唑醇的敏感性间无相关性。

图5显示，吡唑醚菌酯与丙环唑对稻瘟病菌的线性回归方程为y=0.402 7x+0.797 1，P=0.501 0(P>0.05)，可知F检验在P=0.05水平上差异不显著；b值为正，但决定系数(R2)为0.251 0，小于0.8，说明稻瘟病菌对吡唑醚菌酯与其对丙环唑的敏感性间无相关性。

图6显示，吡唑醚菌酯与多菌灵对稻瘟病菌的线性回归方程为y=-0.003 8x-0.374 7，P=0.014 6(P<0.05),可知F检验在P=0.05水平上差异显著；b值为负，但决定系数(R2)为0.000 2，小于0.8，说明稻瘟病菌对吡唑醚菌酯与其对多菌灵的敏感性间不相关。

综上所述，稻瘟病菌对吡唑醚菌酯及其对戊唑醇、丙环唑、多菌灵的敏感性之间不存在明显的相关性。

3 讨 论

监测水稻病原菌对杀菌剂的敏感性，有助于优化杀菌剂的使用策略[26]。吡唑醚菌酯是QoI类内吸性杀菌剂，具有低毒、高效、广谱及对非靶标生物安全的优点，2017年登记用于防治稻瘟病，具有很高活性，防治效果达98.53%[18,35]。研究表明，吡唑醚菌酯对川渝地区稻瘟病菌的EC50值为0.003 13～0.024 48 μg/mL，EC50平均值为0.009 17 μg/mL[4]；吡唑醚菌酯对长江中下游地区稻瘟病菌的EC50值为0.003～0.027 μg/mL，EC50平均值为0.012 μg/mL[18]。本研究结果表明，吡唑醚菌酯对福建省稻瘟病菌的EC50值为0.001 2～0.012 8 μg/mL，EC50平均值为0.004 7 μg/mL，低于川渝和长江中下游地区[4,18],可知福建省稻瘟病菌对吡唑醚菌酯比较敏感；且敏感性频率分布为连续性单峰曲线，符合连续的偏正态分布。本研究中的供试菌株均来源于未施用过吡唑醚菌酯的稻田，因此，可将EC50平均值0.004 7 μg/mL作为福建省水稻稻瘟病菌对吡唑醚菌酯的敏感基线。目前，虽未见稻瘟病菌对吡唑醚菌酯田间抗性的报道，但吡唑醚菌酯作用位点单一，频繁使用易产生抗药性。已有多种病原菌对吡唑醚菌酯产生了抗药性，贺瑞等[19]研究发现，海南省芒果蒂腐病菌对吡唑醚菌酯普遍产生了抗药性，抗药性最高菌株的EC50值是最敏感菌株的488倍；肖婷等[20]研究发现，江苏丘陵地区田间草莓灰霉病菌对吡唑醚菌酯产生高水平抗药性。由此可知，作为防治水稻稻瘟病的主要杀菌剂，吡唑醚菌酯存在较大的抗性风险，建议将吡唑醚菌酯与不同作用机理的杀菌剂轮换使用，以避免或减缓稻瘟病菌对其抗药性的产生。

戊唑醇和丙环唑均属于DMIs类杀菌剂。魏松红等[36]研究报道，辽宁稻瘟病菌对戊唑醇的敏感基线为0.383 3 μg/mL；鲜菲[21]研究表明，西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感基线为0.215 4 μg/mL；赵琪君等[7]研究表明，湖北、贵州稻瘟病菌对丙环唑的敏感基线为3.99 μg/mL。本研究结果表明，戊唑醇对供试稻瘟病菌的EC50平均值为0.361 9 μg/mL，丙环唑对供试稻瘟病菌的EC50平均值为0.812 4 μg/mL，表明福建省稻瘟病菌对戊唑醇、丙环唑仍比较敏感。

多菌灵属于苯并咪唑类杀菌剂，具有广谱、低毒的优点[37]。方敏彦[38]研究表明，多菌灵对稻瘟病菌的EC50值为0.137～0.314 μg/mL。本研究结果表明，多菌灵对供试稻瘟病菌的EC50平均值为0.427 9 μg/mL，表明福建省稻瘟病菌对多菌灵仍比较敏感。已有报道表明，稻瘟病菌和油茶炭疽病菌[22]、小麦赤霉病菌[39]等病原菌对戊唑醇、丙环唑和多菌灵出现了抗药性。鲜菲[21]发现，重庆涪陵和四川宣汉出现低抗水平的稻瘟病菌；赵琪君等[7]发现，湖北、贵州稻瘟病菌对丙环唑已经出现敏感性下降的亚群体；李河等[22]分离到6株对多菌灵和戊唑醇均产生了抗性的油茶炭疽菌；王建秀等[39]在小麦产区已经监测到对多菌灵产生抗药性的禾谷镰刀菌菌株；周华飞等[40]发现，江苏地区小麦赤霉病菌对多菌灵的抗性频率为26.3%～54.5%。因此，福建省稻瘟病菌对戊唑醇、丙环唑和多菌灵虽未产生敏感性下降的抗药性亚群体，但戊唑醇、丙环唑和多菌灵具有一定的抗药性风险，应注意不同作用机理杀菌剂的轮换或混配使用。

不同作用机理的杀菌剂混配或轮换使用可以降低或延缓抗药性的出现[32,41]。本研究结果表明，吡唑醚菌酯、戊唑醇、丙环唑和多菌灵对稻瘟病菌均具有较高的毒力，其对稻瘟病菌菌丝生长的抑制活性依次表现为吡唑醚菌酯>戊唑醇>多菌灵>丙环唑，且稻瘟病菌对吡唑醚菌酯与戊唑醇、丙环唑、多菌灵的敏感性间不存在明显的相关性。Miao等[42]研究表明，QoI类杀菌剂肟菌酯对水稻稻瘟病菌具有较高的毒力，与吡唑醚菌酯存在交互抗性，与多菌灵、稻瘟灵、百菌清、咪鲜胺等不存在交互抗性。因此，可以选用吡唑醚菌酯作为主要杀菌剂防治水稻稻瘟病，并与戊唑醇、丙环唑和多菌灵等不同作用机理的杀菌剂混配或轮换使用。