LncRNA GAS5靶向miR-103减轻3T3L1脂肪细胞胰岛素抵抗的作用机制

敖文，徐在革，白杨，刘惠双

随着经济发展、人口老龄化加剧，2型糖尿病的患病率呈迅速升高趋势，已成为继肿瘤、心血管疾病之后的第3大死亡诱因［1］。2型糖尿病发病机制主要为胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）和胰岛素分泌不足，其中IR贯穿疾病整个阶段［2-3］。控制和改善IR是预防和治疗糖尿病的根本。长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）可以通过多条途径靶向调控胰岛素相关基因表达，从而影响IR的形成以及胰岛素的合成、分泌，这为治疗糖尿病提供了新思路［4］。生长抑制特异因子5（growth arrestspecific 5，GAS5）在2型糖尿病患者血清中呈低表达，GAS5可结合胰岛素受体启动子，其缺失可抑制葡萄糖摄取和胰岛素信号转导［5］。微小RNA（microRNA，miRNA）亦参与IR过程，miR-103作为2型糖尿病的潜在标志物，对预测2型糖尿病预后具有较高的价值［6］。另有研究发现，GAS5与miR-103之间存在靶向结合位点［7］。GAS5是否通过miR-103在IR中发挥作用尚不明确。本研究通过肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α诱导3T3L1脂肪细胞建立IR模型，探究GAS5对IR的影响，并初步探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 3T3L1小鼠前脂肪细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库（编号：KCB 92010YJ）。胰岛素、地塞米松、异丁基甲基黄嘌呤（IBMX）、TNF-α（美国sigma公司）；pEGFP-C1-GAS5、引物均由上海生工生物有限公司合成；Lipofectamine™3000、mimic NC、miR-103 mimic由广州锐博生物有限公司合成；Krebs-Ringer缓冲液（北京Solarbio公司）；一抗胰岛素受体底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）、p-IRS-1、过氧化物酶体增殖物激 活 受 体γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ）、葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter protein 4，GLUT4）、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、p-AKT、βactin，羊抗兔二抗，双荧光素酶报告基因检测试剂盒（英国abcam公司）；实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）仪（美国ABI公司，型号：QuantStudio 3）；全自动凝胶成像分析系统（上海Tanon公司，型号：4100）。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养及模型建立 3T3L1小鼠前脂肪细胞在10%胎牛血清DMEM培养液中置于37℃、5%CO2培养箱中培养、传代，待细胞密度达70%，参考文献［8］添加含10 mg/L胰岛素、1μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX的10%胎牛血清DMEM培养液诱导分化48 h，含10 mg/L胰岛素的DMEM培养液继续培养48 h，10%胎牛血清DMEM培养液再继续培养4 d，油红O染色鉴定细胞分化情况。添加10 ng/L TNF-α继续培养24 h，建立3T3L1脂肪细胞IR模型。

1.2.2 细胞分组 实验分为对照组、模型组、空载体组、GAS5过表达组、GAS5过表达+mimic NC组、GAS5过表达+miR-103 mimic组。对照组为3T3L1脂肪细胞，其余各组细胞为IR模型细胞，空载体组、GAS5过表达组、GAS5过表达+mimic NC组、GAS5过表达+miR-103 mimic组参考Lipofectamine™3000说明书分别转染pEGFP-C1空载体、pEGFP-C1-GAS5、pEGFP-C1-GAS5+mimic NC、pEGFP-C1-GAS5+miR-103 mimic，转染6 h。

1.2.3 qPCR检测细胞中GAS5、miR-103mRNA水平 收集转染并培养后的各组细胞，每组各收集3孔，每孔1 mL，每孔各加1 mL Trizol试剂，Trizol法提取细胞总RNA，cDNA合成试剂盒合成cDNA，qPCR检测细胞中GAS5、miR-103mRNA水 平。GAS5引 物：上 游5′-AAGCCATTGGCACACAG⁃GCATTAG-3′，下游5′-AGAACCATTAAGCTGGTCCAGGCA-3′；β-actin引物：上游5′-CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3′，下游5′-AAGGAAGGCTGGAACAGTGC-3′；miR-103引物：上游5′-AGCAGCATTGTACAGGGCTATGAA-3′，下 游5′-TG⁃GTGTCGTGGAGTCG-3′；U6引物：上游5′-CGCTTCGGCAG⁃CAGCACATATAC-3′，下游5′-AATTTGCGTGTCATCCTTGC-3′。反应体系（20μL）：1μL cDNA（200μg/L）、10μL 2×SYBR qPCR Mix、上游引物/下游引物（均为10μmol/L）0.5 μL/0.5μL，8μL ddH2O；反应条件：94℃60 s；95℃30 s，60℃30 s，40个循环。2-ΔΔCt法计算GAS5、miR-103mRNA相对表达水平。

1.2.4 液体闪烁法检测葡萄糖摄取能力 实验前1 d各组置于24孔板中，均用含0.2%胎牛血清白蛋白的无血清DMEM培养液培养过夜，用含0.2%胎牛血清白蛋白的Krebs-Ringer缓冲液作用2 h，每孔添加50μL含有1.85×105Bq（约5μCi）2-脱氧3［H］葡萄糖的2-脱氧葡萄糖混合液孵育5 min，磷酸盐缓冲液清洗，干燥后室温添加500μL Triton X-100裂解细胞30 min，取400μL裂解液于液闪计数器下检测葡萄糖摄取量。

1.2.5 Western blot检测细胞中IRS-1、p-IRS-1、PPARγ、GLUT4、AKT、p-AKT蛋白相对表达水平 磷酸盐缓冲液清洗细胞，添加蛋白裂解酶冰上裂解细胞10 min，收集至1.5 mL的EP管中，4℃、12 000 r/min离心20 min，收集上清液至新的EP管中即为总蛋白。BCA试剂盒测定蛋白浓度，每孔上样20μg，聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白、NC转膜、5%脱脂奶粉室温封闭NC膜2 h，对应一抗IRS-1、p-IRS-1、PPARγ、GLUT4、AKT、p-AKT（稀释比例均为1∶300）、β-actin（1∶500），4℃孵育过夜；加入羊抗兔二抗（1∶1 000）室温孵育1 h，显色液避光显色，全自动凝胶成像分析系统检测蛋白表达情况。

1.2.6 双荧光素酶鉴定miR-103与GAS5的靶向位点 生物信息学在线网站Targetscan（http://www.targetscan.org/）预测miR-103与GAS5存在互补的结合位点；将miR-103与GAS5结合位点及突变位点的序列克隆重组至pGL3-basic荧光素酶报告载体上构建GAS5野生型（GAS5 WT）及突变型（GAS5 MUT）荧光素酶报告载体，分别与miR-103 mimic或mimic NC共转染至3T3L1脂肪细胞中，双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶相对活性。

1.3 统计学方法 采用GraphPad Prim 8.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较行单因素方差分析，组间多重比较行SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3T3L1脂肪细胞分化情况 诱导前，脂肪细胞呈梭形，与成纤维细胞形态类似，突触伸展于细胞间隙形成网状，细胞质中未见红色脂滴；诱导后，脂肪细胞呈圆形、胞体变大，胞浆丰富，含有大量脂滴，油红染色明显，呈“指环样”结构，模型构建成功，见图1。

Fig.1 The establishment of 3T3L1 adipocyte models(Oil red O staining,×400)图1 3T3L1脂肪细胞模型制作（油红O染色，×400）

2.2 各组GAS 5、miR-103mRNA水平比较 与对照组比较，其他各组细胞中GAS 5mRNA水平降低，模型组、空载体组、GAS5过表达+miR-103 mimic组细胞中miR-103mRNA水平升高（P＜0.05）；与模型组、空载体组比较，GAS5过表达组、GAS5过表达+mimic NC组细胞中GAS5mRNA水平升高，而miR-103mRNA水平降低（P＜0.05）；与GAS5过表达组、GAS5过表达+mimic NC组比较，GAS5过表达+miR-103 mimic组细胞中GAS5mRNA水平降低，miR-103mRNA水平升高（P＜0.05），见表1。

Tab.1 Comparison of GAS5,miR-103 mRNA levels and glucose uptake capacity between 6 groups of cells表1 6组细胞中GAS5、miR-103 mRNA水平和葡萄糖摄取能力比较 （n=6，±s）

Tab.1 Comparison of GAS5,miR-103 mRNA levels and glucose uptake capacity between 6 groups of cells表1 6组细胞中GAS5、miR-103 mRNA水平和葡萄糖摄取能力比较 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01，a与对照组比较，b与模型组比较，c与空载体组比较，d与GAS5过表达组比较，e与GAS5过表达+mimic NC组比较，P＜0.05；模型组、空载体组均不与GAS5过表达+miR-103 mimic组比较，未标注。

组别对照组模型组空载体组GAS5过表达组GAS5过表达+mimic NC组GAS5过表达+miR-103 mimic组F GAS5 mRNA 1.01±0.09 0.36±0.05a 0.35±0.06a 0.87±0.08abc 0.86±0.07abc miR-103 mRNA 0.99±0.08 3.47±0.32a 3.44±0.34a 1.39±0.15bc 1.40±0.15bc葡萄糖摄取（cpm）1 356.39±146.48 675.43±73.91a 684.79±76.36a 1 241.88±147.69bc 1 237.75±134.82bc 0.47±0.05ade 2.67±0.25ade 867.49±92.36ade 110.194＊＊132.922＊＊41.075＊＊

2.3 各组葡萄糖摄取能力比较 与对照组比较，模型组、空载体组、GAS5过表达+miR-103 mimic组细胞葡萄糖摄取能力降低（P＜0.05）；与模型组、空载体组比较，GAS5过表达组、GAS5过表达+mimic NC组细胞葡萄糖摄取能力提高（P＜0.05）；与GAS5过表达组、GAS5过表达+mimic NC组比较，GAS5过表达+miR-103 mimic组细胞葡萄糖摄取能力降低（P＜0.05），见表1。

2.4 各组IRS-1、p-IRS-1、PPARγ、GLUT4、AKT、p-AKT蛋白相对表达水平比较 与对照组比较，模型组、空载体组、GAS5过表达+miR-103 mimic组细胞中p-IRS-1/IRS-1、PPARγ、GLUT4、p-AKT/AKT蛋白水平降低，GAS5过表达组、GAS5过表达+mimic NC组细胞中PPARγ、GLUT4蛋白水平降低（P＜0.05）；与模型组、空载体组比较，GAS5过表达组、GAS5过表达+mimic NC组细胞中p-IRS-1/IRS-1、PPARγ、GLUT4、p-AKT/AKT蛋白水平升高（P＜0.05）；与GAS5过表达组、GAS5过表达+mimic NC组比较，GAS5过表达+miR-103 mimic组细胞中p-IRS-1/IRS-1、PPARγ、GLUT4、p-AKT/AKT蛋白水平降低（P＜0.05）。见图2、表2。

Fig.2 Protein levels of IRS-1,p-IRS-1,PPARγ,GLUT4,AKT,and p-AKT in 6 groups of cells图2 各组细胞中IRS-1、p-IRS-1、PPARγ、GLUT4、AKT、p-AKT蛋白相对表达水平

2.5 miR-103与GAS5的靶向位点验证 生物信息学分析miR-103与GAS5存在互补的结合位点，见图3。mimic NC+GAS5 WT组、miR-103 mimic+GAS5 WT、mimic NC+GAS5 MUT、miR-103 mimic+GAS5 MUT的荧光素酶相对活性分别为1.01±0.12、0.48±0.06、0.99±0.08、0.98±0.11，差异有统计学意义（n=6，F=43.419，P＜0.05），其中与mimic NC+GAS5 WT比较，miR-103 mimic+GAS5 WT荧光素酶相对活性下降（P＜0.05）；mimic NC+GAS5 MUT与miR-103 mimic+GAS5 MUT荧光素酶相对活性差异无统计学意义（P＞0.05）。

Fig.3 Targeting sites of miR-103 and GAS5图3 miR-103与GAS5的靶向位点

3 讨论

目前，临床主要通过胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物改善IR，促进前脂肪向脂肪转化、增加细胞内游离脂肪酸的含量和细胞内三酰甘油的积聚，从而降低血浆游离脂肪酸水平，增加组织对胰岛素的敏感性［9-10］；但会增加患者饥饿感，促进患者饮食，导致体质量和体脂比例增加，造成肥胖［11］。因此，寻找能调控IR的基因，避免药物影响，对IR相关疾病治疗可能更有意义。本研究结果显示，制备IR模型后，与对照组比较，模型组细胞中GAS5mRNA水平降低、miR-103mRNA水平升高，表明IR模型中GAS5、miR-103基因表达水平发生改变，提示在IR中基因表达水平变化可能影响疾病，改变基因表达水平可能作为新的治疗方法。

LncRNA已成为生物学研究热点之一，其参与IR发生、发展，成为代谢疾病发展过程中肝脏IR的精确指标，可用于IR相关疾病的早期诊断和治疗［12］。过表达H19可通过靶向调节异质性胞核核糖核蛋白A1，促进脂肪酸氧化，进而减少骨骼肌中异位脂质积累，改善IR［13］。GAS5位于1q25.1染色体上，在生长停滞成纤维细胞内首次被发现，靶向提高GAS5水平，可增加脂肪细胞中胰岛素受体的表达［14］。GAS5作为糖皮质激素受体拟似物，通过竞争性结合糖皮质激素，达到抑制糖皮质激素的生物学效应目的，而糖皮质激素对IR具有促进作用［15］。本研究结果显示，与模型组比较，GAS5过表达组细胞中GAS5mRNA表达水平、葡萄糖摄取能力、细胞中p-IRS-1/IRS-1、PPARγ、GLUT4、p-AKT/AKT蛋白水平升高，表明GAS5过表达可提高细胞的葡萄糖摄取能力，提示该作用可能与IRS-1相关蛋白表达水平有关。IRS-1作为胰岛素信号通路连接细胞外蛋白，其活化水平影响胰岛素的生理效应，IR发生时，受炎症、高胰岛素血症影响，IRS-1磷酸化减弱，胰岛素信号通路被抑制，进一步加重IR［16］。PPARγ是活化配体的核受体超家族的一个成员，在IR时水平降低，具有胰岛素增敏功能；PPARγ直接调控的下游靶蛋白GLUT4在IR时下调，可减少细胞对葡萄糖转运摄取，引发脂肪IR［17］。Feng等［18］研究显示，IRS-1/PI3K/AKT信号通路在糖原合成、葡萄糖转运中发挥重要作用，上调IRS-1、AKT的磷酸化水平，可促进胰岛素信号转导，减轻IR引起的肝损伤。本研究亦显示，GAS5能够促进p-IRS-1/IRS-1、PPARγ、GLUT4、p-AKT/AKT蛋白表达，恢复胰岛素信号转导，减轻IR。

Tab.2 Comparison of protein levels of IRS-1,p-IRS-1,PPARγ,GLUT4,AKT and p-AKT between 6 groups of cells表2 6组细胞中IRS-1、p-IRS-1、PPARγ、GLUT4、AKT、p-AKT蛋白水平比较 （n=6，±s）

Tab.2 Comparison of protein levels of IRS-1,p-IRS-1,PPARγ,GLUT4,AKT and p-AKT between 6 groups of cells表2 6组细胞中IRS-1、p-IRS-1、PPARγ、GLUT4、AKT、p-AKT蛋白水平比较 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，c与空载体组比较，d与GAS5过表达组比较，e与GAS5过表达+mimic NC组比较，P＜0.05；模型组、空载体组均不与GAS5过表达+miR-103 mimic组比较，未标注。

组别对照组模型组空载体组GAS5过表达组GAS5过表达+mimic NC组GAS5过表达+miR-103 mimic组F IRS-1 1.19±0.12 1.21±0.11 1.16±0.15 1.20±0.13 1.22±0.14 1.19±0.13 0.151 p-IRS-1/IRS-1 0.88±0.09 0.57±0.06a 0.59±0.05a 0.79±0.08bc 0.80±0.08bc 0.66±0.07ade 18.000＊＊PPARγ 1.43±0.15 0.86±0.09a 0.88±0.07a 1.21±0.13abc 1.20±0.13abc 0.97±0.09ade 23.580＊＊GLUT4 1.36±0.15 0.48±0.05a 0.49±0.06a 0.87±0.08abc 0.84±0.09abc 0.59±0.07ade 83.683＊＊AKT 0.88±0.09 0.89±0.10 0.86±0.11 0.84±0.09 0.90±0.09 0.91±0.07 0.477 p-AKT/AKT 0.68±0.07 0.45±0.06a 0.46±0.07a 0.62±0.07bc 0.63±0.06bc 0.51±0.04ade 14.548＊＊

miRNA在IR中发挥重要作用，miR-103为GAS5靶位点之一，可影响IR，并通过抑制PI3K/AKT通路的激活，引起多囊卵巢综合征、肥胖、胰岛素抵抗、雄激素过多、不孕等［19］。miR-103在抑郁症合并IR中与IR指数、抑郁严重程度呈正相关，且为IR指数的影响因素［20］。在本研究中，双荧光酶靶向关系结果证实，miR-103是GAS5的靶位点，升高GAS5的表达能够降低miR-103的表达，在升高GAS5的基础上过表达miR-103能够降低葡萄糖摄取，降低细胞中p-IRS-1/IRS-1、PPARγ、GLUT4、p-AKT/AKT蛋白表达水平，且miR-103在IR时高表达；miR-103能够逆转GAS5功能，提示在脂肪细胞IR中GAS5低表达，升高GAS5的表达能够靶向抑制miR-103的表达，从而缓解脂肪细胞IR。

综上所述，升高GAS5的表达能够抑制脂肪细胞IR，可能与靶向抑制miR-103有关，但miR-103的下游靶基因较多，其具体靶向蛋白尚需进一步研究。