不同管理方式下秋季刺参养殖环境中菌群结构分析

王玉龙，林青，孙亚慧，王文琳，张津源，周玮

（1.大连海洋大学,水产与生命学院，辽宁 大连 116023；2.辽宁轻工职业学校，辽宁 大连 116100；3.大连海葵环境监测科技有限公司，辽宁 大连 116000）

刺参（Apostichopus japonicus）营养和经济价值较高，已经成为辽宁和山东等地的重要养殖对象之一[1-3]。2018 年全国海参产量约1.74 万t，养殖面积达到2.38 万hm2[4]。刺参多以池塘养殖为主。为打破制约刺参养殖业发展的瓶颈，近年来大力推广微孔曝气装置，辅助调控水质取得了很好的效果。如快速增氧和去除底泥中有机质等，但在使用过程中存在易堵塞和维护费用高的缺点[5,6]。本研究团队研发了养水机辅助水质调控设备，在实际调控水质中较于前两种方式具一定优势[7-9]。

在生产中，可通过换水和水质调控设备辅助保持较好养殖水质，但环境中微生物在养殖池塘中物质循环和能量流动、改善水质环境以及刺参健康中起到了关键作用[10]。如假交替单胞菌（Pseudoalteromonas nigrifaciens）、假单胞菌（Pseudoalteromonas）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）等都可使刺参患病[11-13]。而枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）等，对养殖环境水质的改善、提高养殖生物的非特异性免疫酶活性以及促进养殖生物生长等都有明显的作用[14-16]。秋季是刺参重要的生长期，养殖环境的变化会对刺参的生长有一定的影响。因此，对秋季刺参养殖池塘环境中菌群结构的研究具有重要的意义。

传统的细菌培养方法存在一定局限性，无法满足细菌群落结构研究的需要[17,18]。近年来，随着分子生物学的发展，尤其是高通量测序技术发展，是研究环境中菌群结构的重要手段[19,20]。目前对刺参池塘养殖中菌群结构的研究，多利用DGGE 指纹图谱技术[21,22]，其存在反应优势菌信息少和操作繁琐等问题，而利用16S rDNA 高通量技术研究刺参养殖池塘的菌群结构，则应用优势明显[10]。本研究利用该技术研究了自然纳潮、微孔曝气和养水机3 种水质管理方式下，参池环境中的菌群结构，以期为参池管理方式的选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验在大连市青堆子海域（N39.78°,E123.32°）的自然纳潮、微孔曝气和养水机池塘3 种海参养殖池中进行。试验池均为矩形，面积都为5.1 hm2，池塘内南深北浅，泥沙池底。实验期间各池塘不投饵和药，统一管理。

养水机是本研究团队自主研发的新型水质调控装置（专利号：ZL200610077526.5）见图1。其工作原理是通过进水管道把池塘表层溶氧量相对较高的水引入到底层动力泵，通过动力泵把表层高溶氧量的水射入底层水体中，实现表底层水体强制交换，使得养殖池塘水体的流动加快，并增加底层水体的溶氧量。此外，水体的强制交换过程有利于养殖池塘水体表底层的混合均匀，对于养殖池塘水体会出现的温度和盐度的分层具有一定的破坏作用，可以降低因水体分层造成养殖池塘底层水体缺氧现象的发生。养水机位于池塘进水口最低处，水泵功率750 W，喷头出水量为12 m3/h，每天21:00—次日9:00 工作12 h。

图1 养水机模拟图Fig.1 Diagram of a water quality regulator

微孔曝气主要由供气装置、气体传输管道和微孔曝气管三部分组成。其工作原理是将空气压缩后通过安装在池底的曝气管，以微气泡的形式向水中扩散。微孔曝气设备在池塘水体缺氧时开启，如阴雨天和夏季高温期适当增加开机时间。

1.2 方法

1.2.1 样品采集

2017 年11 月按照《国家海洋调查规范》（GB/T12763）的方法采集三种实验池塘水样和泥样，样品标记信息见表1。样品立即放入-80℃液氮冷冻后，再用干冰冷冻运送到北京诺禾致源科技股份有限公司测定。具体的样品采集步骤见参考文献郭超等[23]。每个样品采集点采集两个平行样品。

表1 样品标记信息Tab.1 Labels of the samples

1.2.2 样品DNA 提取、PCR 扩增和测序

用CTAB 法提取样本DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA，确保取得样品DNA 的完整性。条带清晰完整无拖尾则视为采集的样品质量合格。使用NanoPhotometerClassic Launched（IMPLEN,GER）测定其纯度，提取成功样品的DNA 保存于-20℃下备用。

应用含有Illumina 接头和barcode 序列的引物341F-806R（Michelsen C F），扩增样品中DNA 的16S rRNA 基因的V3～V4 可变区。最后应用Illumina Miseq 测序平台完成序列测序。

1.2.3 数据处理及生物信息学分析

首先，处理获得的原始序列，保留有效序列。接着使用FLASH 和QIIME[24,25]软件将序列拼接为tags，然后对tags 进行聚类。根据Greengenes 数据库进行分类学注释。最后，计算各个样品的细菌群落相对丰度。应用PAST 软件[24]计算6 个样品中的细菌群落的α-多样性。

2 结果与分析

2.1 细菌群落分类学注释

由图2 可知，6 个样品中总tags 平均值为81 111，可分类的tags 平均值为70 794，无法分类的tags 平均值为2，非沉余tags 平均值为10 315，运算分类单元平均值为926。

图2 三种刺参池塘水体和底泥微生物群落高通量测序得到的序列数目及运算分类单元数目Fig.2 The number of sequences of the microbial communities and the number of operational taxa in the waters and sediments in the three sea cucumber culture ponds by high-throughput sequencing

在养水机池塘水体和底泥中分别检测出47 个门、100 个纲、448 个属和56 个门、107 个纲、362 个属的细菌。微孔曝气池塘水体和底泥中分别检测出44 个门、127 个纲、386 个属和60 个门、128 个纲、450 个属的细菌。自然纳潮池塘水体和底泥中分别检测出44 个门、98 个纲、398 个属和55 个门、107个纲、440 个属的细菌。

2.2 细菌群落结构分析

三种刺参养殖池塘水体和底泥菌群结构特征见图3。由图3 可知：在门水平上，三种池塘6 个样品中相对丰富度占比前10 的门（图3-a）分别为：变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinocteria）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）。其占比为92.96%～99.05%。三种池塘底泥和水体中的绝对优势菌门都是变形菌门，相对丰富度占55.86%～70.86%。

图3 不同水质调控方式下参池养殖环境中菌群结构特征Fig.3 Characteristics of bacterial flora in sea cucumber culture ponds under different water quality regulation methods

在纲水平上，6 个样品中相对丰富度占比前10的纲（图3-b）占比67.22%～92.76%。三种池塘底泥和水体中的绝对优势菌门都是变形菌门，相对丰富度占比55.86%～70.86%。在水样中三种池塘的Alphaproteobacteria 和Gammaproteobacteria 都是占比前两位的优势菌纲，相对丰度占比42.13%～63.45%。三种池塘的底泥样品中Gammaproteobacteria 和Deltaproteobacteria 都是占比前两位的优势菌纲，相对丰度占38.54%～50.56%。

在属水平上，6 个样品中相对丰富度占比前30的属（图3-c）占比15.16%～47.04%。在6 个样品中各自的第一优势菌属有所不同，养水机池塘水样中未确定（unidentified）的_Chloroplast（相对丰度为7.37%），微孔曝气和自然纳潮池塘是Lentibacter（相对丰度为13.17%和7.70%）。养水机池塘底泥样品中是Desulfobulbus（相对丰度分别为1.94%），微孔曝气和自然纳潮池塘是Sulfurovum（相对丰度分别为5.84%和4.88%）。

2.3 菌群多样性

2.3.1 α-多样性分析

6 个样品的文库覆盖率均大于0.970，说明本试验数据具有较高的可信度。三种不同池塘底泥和水体样本细菌群落的α-多样性指数值见表2。由表2 可知，养水机池塘水样中Chao、AC、Shannon 和Simpson 指数最高，微孔曝气池塘水样的Chao、ACE、Shannon 和Simpson 指数最低。

表2 不同水质调控方式下池塘细菌的高通量测序结果Tab.2 High throughput sequencing results of bacteria in sea cucumber culture ponds under different water quality control methods

养水机池塘泥样中Chao 和ACE 指数最低。自然纳潮池塘的Shannon 指数最低。微孔曝气池塘的Chao、ACE 和Shannon 指数都最高，而Simpson 指数最低。三种池塘的Simpson 指数一致。

随着随机抽取的序列总数的增加，Chao1、observed species 和Shannon 曲线图（图4），各个样品的三种曲线到达60 000 这个临界值时都趋于平缓，表示测序结果已经可以反映当前样品所包含的多样性。继续增加测序深度已不能检测到数量较多且尚未发现的新类型OUT。

图4 OUT 数目的稀释曲线图Fig.4 Dilution curve of OUT number

2.3.2 β-多样性分析

由图5 可知，第1 主坐标（PCoA1）、第2 主坐标（PCoA2）和第3 主坐标（PCoA3）的贡献率分别为17.54%、12.28%和6.61%，三者累计贡献率为36.43%。三种池塘水样与底泥样品的距离相对较远。水样的样品中微孔曝气池塘和自然纳潮池塘距离较近，而养水机池塘与其他两种池塘相聚较远，但离泥样的距离比其他两种池塘要近。在底泥样品中养水机池塘与自然纳潮池塘较近，这两种池塘较微孔曝气池塘较远。这表明在水样中微孔曝气池塘和自然纳潮池塘菌群结构差异性小，相似度高。而在底泥样品中养水机池塘和自然纳潮池塘菌群结构差异性小，相似度高。

图5 UniFrac PCoA 分析的样品三维排序图Fig.5 3 D ordered map of Sample dilution curve by UniFrac PCoA analysis

3 讨论

3.1 不同水质调控方式下参池环境中菌群多样性

Chao1、ACE、Shannon 和Simpson 指数可用于评价细菌群落多样性、物种丰富度和均匀度。根据保险假说（Insurance hypothesis），高生物多样性有利于提高生态系统的稳定性[27]。表2 中三种池塘的Chao1、ACE、Shannon 和Simpson 指数都是底泥中高于水中，这与闫法军等[28]和Zhao 等[29]的研究结果一致。这是因为海洋沉积物表层环境微生物量约占到海洋微生物总量的70%[30]。三种池塘水环境中，养水机池塘的Chao1、ACE、Shannon 和Simpson 指数均最高，微孔曝气池塘最低。这是因为养水机池塘长时间的水体循环，使得池塘内各水层间的浮游植物量和菌群分布相较于其他两个池塘更为均匀[31,32]。浮游植物光合作用产生的有机质会促进细菌的大量繁殖[31]。其次，养水机长时间的工作使水体扰动，底泥中的细菌随着再悬浮颗粒进入水体。图5 的UniFrac PCoA 分析中表明，养水机池塘水中样品离底泥样品比其他两种池塘更近，可能与这个原因有关。虽然，微孔曝气池塘同样会造成水体扰动，但其在实际生产使用主要是为了快速给池塘增氧，开机时间相对较短，不会产生像养水机池塘那样明显的效果。高溶氧量会抑制厌氧细菌[10]。但三种池塘底泥中的结果反之。有研究表明，有机物含量对环境中菌群的多样性和丰度有正相关关系[30,34-36]。因此，养水机池塘水环境中菌群多样性最高。这对于水体较浅易受外界环境影响的刺参池塘，有利于养殖水体环境的稳定，可以一定程度抑制病原菌的大量繁殖，有利于刺参的存活。

3.2 不同水质调控方式参池环境中菌群特征

近年来，对刺参池塘环境中菌群群落组成已有报道。谭八梅等[37]、丁斯予等[38]和Zhao 等[29]研究发现，秋季刺养殖池塘水体和底泥中，第一和第二优势菌门均为变形菌门和拟杆菌门，前者为绝对优势菌门。这与本研究的3 种刺参养殖池塘的水体和底泥中菌群组成结果相似，其中，三种池塘的第一优势菌门一致，为变形菌门（相对丰度为55.86%以上）。由图3-a 可知，在刺参养水机池塘水体的第二优势菌门为厚壁菌门，其他两种池塘都为拟杆菌门。这可能是因为水温的降低使得养水机池塘水体中厚壁菌门相对丰度变大[36]。微生物在分解底泥中有机质时释放热量会使间隙水水温升高8.5℃[39,40]。夜间养水机设备工作时，将表层的低温水与底层高温水交换，使得池塘内底层水体温度加速下降。而芽孢杆菌纲内的物种具有较强的环境适应性[41]。因此养水机池塘内第二优势菌门有别于其他两种池塘。董春光等[14]发现，厚壁菌门的枯草芽孢杆菌对养殖水体中的NO3--N 和NO2--N 有一定的去除作用，提升养殖水质的同时促进了刺参的生长。养水机池塘水体环境在一定程度上要优于其他两种池塘。

在养水机、微孔曝气和自然纳潮3 种水质调控方式下，刺参养殖池塘底泥中，第二优势菌门分别为拟杆菌门、绿湾菌门和厚壁菌门。养水机池塘和微孔曝气池塘与其他的研究结果不一致，可能是因为增加水体溶氧量时对水体产生扰动有关。姚丽平[42]研究发现，不同曝气强度影响底泥中细菌结构分布和其在物质循环过程中的作用。如流速为0.247 m/s、对应溶氧为6.18 mg/L、雷诺数为1 311 的曝气条件下，以厚壁菌门和变形菌门为优势菌群，且对硫酸盐还原菌生长有促进作用。自然纳潮池塘厚壁菌门中的芽孢杆菌纲（Bacilli）和梭菌纲（Clostridia）为主要优势菌纲，其相对丰度分别为7.07%和3.83%（图3-b）。孙永旭等[43]研究发现，缺氧组花鲈（Lateolabrax maculatus）肠道菌群变形菌门相对丰度显著下降，而梭菌纲和拟杆菌纲明显上升。自然纳潮池塘相较于其他两种池塘，细菌丰度变化趋势与缺氧组花鲈肠道菌群丰度一致，说明自然纳潮池塘的溶氧要低于其他两种池塘。三种池塘中优势菌门、纲和属是一致的（图3），其差异主要表现在各优势菌门的相对丰度有所不同。这可能是养殖池塘内环境不同所致[44,45]。说明刺参养殖池塘管理方式的不同，不能改变养殖环境中优势菌群结构，但可以改变优势菌群的相对丰度。