益生菌在虹鳟养殖中的研究与应用

樊丹，李绍戊，卢彤岩，王荻

（1.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306；2.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江省水生动物病害与免疫重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150070；3.上海海洋大学国家水生动物病原库，上海 201306）

益生菌一词由拉丁语“pro”（代表）和“bios”（生命）构成。粮食及农业组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）则将益生菌定义为一种对宿主具有一定积极作用的活微生物。Basoulis 等认为，益生菌是活的微生物（细菌、酵母），足量使用可对宿主产生积极作用[1-3]。目前，益生菌被定义为对宿主健康有有益影响的微生物或化合物，其中微生物包括酵母菌、细菌和藻类[4]。自20 世纪80 年代以来，益生菌在水产养殖中的应用越加广泛。

虹鳟（Oncorhynchus mykiss）营养丰富、风味独特而广受消费者喜爱,是一种适应性较广的冷水性鱼类。随着养殖规模的扩大，机体免疫力下降等问题严重制约着我国虹鳟养殖产业的健康发展。尽管渔用药物仍然是控制病害的主要手段，但片面追求时效与经济利益以及养殖从业人员科学用药意识淡薄，抗生素滥用现象严重，带来药物残留、微生物耐药性等食品卫生和环境安全问题。使用益生菌能提高虹鳟的生长性能，增强免疫功能，减少用药剂量[5-9]。

益生菌在医疗、生物发酵、基因工程等方面的研究和应用广泛，但在虹鳟养殖中尚缺乏系统性研究的综述。本文简要介绍了益生菌的分类、补充方式，综述了益生菌在虹鳟养殖中的应用研究进展，归纳了其对虹鳟的益生效果及益生机理，可为发展绿色高效的虹鳟养殖产业提供参考。

1 益生菌分类

根据2013 年《中华人民共和国农业部第105号公告》，允许饲料使用的微生物添加剂如表1 所示。在虹鳟养殖及相关研究与应用中，常用的益生菌包括：乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌以及其他菌类。其中，乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是厌氧或兼性厌氧的细菌，在自然界分布广泛。从细菌分类学上可分为：乳酸杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、链球菌属（Streptococcus）、肠球菌属（Enterococcus）、乳球菌属（Lactococcus）、片球菌属（Pediococcus）和奇异菌属（Atopobium）等[10]。乳酸菌是一类革兰氏阳性菌，适宜生长温度为37℃左右，最适pH5.5～6.5，在肠道发酵产生有机酸和酶等物质，对宿主的生理功能、免疫系统、营养状态、毒性反应、应激反应等具有重要调节作用[11]，是健康动物肠道中的优势菌群，可维持肠道微生态平衡和机体健康[12]。芽孢杆菌中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）较为常用，它是一种好氧型革兰氏阳性菌，耐高温、耐酸碱、耐防腐剂，在饲料制作中易存活、易加工、便于储藏[13]。酵母菌是一类以芽殖为主的兼性厌氧型真菌，适宜生长温度为25℃，富含蛋白质、B 族维生素、矿物质等多种营养物质和辅酶A、辅酶I 及辅酶Q 等酶类，能够促进肠道其他益生菌的生长，提高水产动物的消化率，增强机体免疫力[14,15]。其他一些菌类也可增强鱼体免疫机能，如沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）可显著提高虹鳟的生长性能[16]。

表1 农业部第105 号公告公布饲料允许的微生物添加剂Tab.1 Microbial feed additives approved in Announcement No.105 of the Ministry of Agriculture

2 益生菌的补充方式

益生菌的补充需要探索最适补给方式、最适剂量，并保证益生菌在干燥的颗粒中存活[17]。种类、剂型、补给载体、剂量水平和投喂时间等因素均影响益生效果。益生菌的补充方式包括：口服、注射和益生菌组合使用，常见的方式为投喂或灌喂。在鱼类养殖中，饲料通常作为有效载体，将益生菌或益生菌细胞成分添加到饲料中，投喂或泼洒至养殖水环境中提供食物或保护剂以防感染[18,19]。Salinas 等[20]将乳酸菌和枯草芽孢杆菌等热灭活后投喂金头鲷（Sparus aurata L.），能有效刺激鱼体免疫系统；Scott等通过腹腔或者肌肉注射方式补充益生菌后，显著提高了虹鳟抵抗嗜冷黄杆菌（Flavobacterium psychrophilum）感染的能力[21]。除单一菌种外，多种益生菌的混合使用对许多物种和养殖水环境均具有积极作用[22,23]。

3 益生菌对虹鳟的益生效果

3.1 生长性能

益生菌具有显著提高虹鳟生长性能的作用。在饲料中添加酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）饲喂虹鳟成鱼90 d 后，其饵料系数（FCR）明显降低，体质量显著增加[24,25]。Merrifield 等给虹鳟饲喂添加了枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）和粪肠球菌（E.faecalis）的混合饲料，其FCR 显著下降，特定生长率提高，表明复合益生菌可有效促进虹鳟生长[26]。保加利亚杆菌（L.elbrueckii subsp.bulgaricus）、嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）和柠檬酸杆菌（Citrobacter farmeri）均可显著提高虹鳟幼鱼的增重率、特定生长率和相对增重率，降低FCR[27]。

3.2 消化酶活性

提高虹鳟肠道消化酶活性有助于机体分解营养物质，提高饲料利用率，促进机体生长发育[9]。长期饲喂含有保加利亚杆菌的饲料能显著提高虹鳟后肠淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性[27]。Reza 等[28]的研究结果与上述相似：当粪肠球菌的补充水平达到1.0×109cfu/g 时，虹鳟肠道的脂肪酶、胰蛋白酶活性显著提高。然而，部分益生菌未影响肠道消化酶的活性，如Harbi 等[29]发现Kocuria SM1 和Rhodococcus SM2 对虹鳟的消化酶指标无影响。

3.3 肠道菌群结构

补充外源益生菌后，虹鳟肠道菌落总数增加，细菌物种丰富度增加，致病菌的粘附性降低，机体免疫力提高[7]。Mohammadian 等[27]研究结果表明，长期饲喂含有嗜酸乳杆菌的饲料后，虹鳟幼鱼肠道的乳酸菌数量和菌落总数显著增加。Sharifuzzaman 等[28]发现：粪肠球菌的补充水平为1.0×108cfu/g 时，虹鳟肠道益生菌数量和菌落总数显著增加。Ramos等[30]发现商业益生菌添加剂（主要为芽孢杆菌、乳酸菌），能促使虹鳟肠道菌落总数显著增加，微生物丰富度显著增加。

3.4 免疫参数

3.4.1 血细胞参数

红细胞增多可增强机体的携氧能力，而白细胞增多通常表示机体免疫应答能力增强[16]。长期投喂含酵母的混合饲料后，虹鳟血液中的红细胞数量无明显变化，白细胞中的单核细胞数量显著增加。在饲料中添加肠杆菌和乳酸菌等同样可以提高虹鳟白细胞数量[27,31,32]。

3.4.2 血清参数

血清参数在一定程度上可以反映机体的健康状况。血清中的胆固醇水平可以反映机体内分泌平衡状态；溶菌酶活性、补体活性、血清蛋白活性、呼吸爆发活性等与免疫反应与生长性能密切相关[17]。Mohammadian[27]和Hoseinifar[33]等研究结果表明，添加酵母菌使虹鳟血清胆固醇水平显著降低，血清溶菌酶活性显著升高，呼吸爆发活性降低，补体活性ACH50显著升高。在饲料中补充添加肠杆菌、乳酸菌、芽孢杆菌等常用益生菌后，虹鳟的血清蛋白、IgM 抗体、组织相容性复合物、免疫球蛋白等蛋白活性增高[7,9,34]。

3.4.3 基因表达

常见的如肿瘤坏死因子、白介素、胰岛素因子等mRNA 表达水平的变化与机体免疫功能或生长性能有关[17]。以乳酸菌为食源益生菌，抑制了虹鳟脾脏中肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素（IL-1β）的mRNA 表达水平；以酵母菌为食源益生菌，脾脏中TNF-α 和IL-1β 的mRNA 表达水平上调[24]。长期补给植物乳杆菌、乳酸乳球菌（L.lactis）和肠系膜球菌（Leuconostic mesenteroides）等益生菌，可促进虹鳟头肾中炎症细胞因子基因（TNF-α 和IL-1β）上调表达，肠道中胰岛素生长因子IGF-2、脂肪酸转运蛋白（FATP）、γ-谷胱甘肽转移酶（γ-GTP）、IL-1β、IL-8和IL-10 基因的mRNA 表达水平显著上调[35-37]。

4 益生菌的益生机制

4.1 铁的竞争

生物需要补充营养以维持生存、生长和繁殖等生命活动。在多种营养元素中，铁元素在DNA 复制、氧气运输、抗氧化应激、酶活性和能量生成等具有重要作用，也是构成铁载体的必需元素[38]。铁载体是细菌或真菌产生的低分子量铁螯合化合物。益生菌产生的铁载体对铁离子具有更高的亲和力，能降低病原对铁的利用性能和对能量的利用能力，增强鱼体的免疫力与抗病性[39-41]。

4.2 抑菌性能

细菌产生细菌素或其他代谢物可抑制甚至杀死其他细菌，以获得更广的生存空间与更多的营养物质[42]。如枯草芽孢杆菌可以产生表面活性素、伊枯草菌素等物质抑制其他细菌的增殖[43]。黏膜免疫相关研究结果表明，致病菌进入水生动物肠道并附着定殖在肠道黏膜表面最终导致疾病[44]，但是益生菌可以抑制病原菌的增殖，阻断其附着位点，降低致病菌与肠道黏膜的结合性能，减少病原菌对宿主的损害[44,45]。保加利亚杆菌能够定殖在鱼肠黏液中，诱导肠道pH 降低，达到抑制病原微生物增殖的效果[46,47]。

4.3 提高酶活性

益生菌能产生不同种类的细胞外酶如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等调节宿主的新陈代谢过程，而鱼体自身能够产生多种内源酶如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、植酸酶、碱性磷酸酶等重要的消化酶[48]。内源性和外源性淀粉酶在草食性和杂食性鱼类中非常重要，能将复杂的多糖物质降解为简单的单糖，促进肠道对糖类物质的吸收[49]。当内源酶的数量和活性不足时，补充益生菌产生的外源性消化酶对提高消化酶活性、营养物质利用率、生长性能和促进消化吸收等具有重要作用[50]。

4.4 免疫调节

鱼类的免疫系统是机体保护其免受病原感染的有效手段。近年来黏膜免疫的研究备受关注，其中有关肠粘膜的相关报道表明，肠黏膜的上皮细胞、黏液、微生物或黏膜下层的免疫细胞能够相互作用，维持肠道正常生理功能，提高肠道的消化吸收能力，增强免疫反应[51]。摄食益生菌可调节肠道微生物组成（通常增加有益微生物的数量），抑制致病菌的增殖。益生菌可诱导黏膜免疫反应激活适应性免疫系统和补体系统，使白细胞增多，细胞因子和趋化因子如TNF-α、白介素（IL-6、IL-10、IL-12）和IFN-C 表达上调，提高宿主抗病能力[52]。Brown等[53]和DeCoffe 等[54]的研究结果也支持该观点。他们还发现鱼类免疫系统的主要活性物质是溶菌酶，能够促进免疫细胞的吞噬作用、呼吸爆发、以及超氧化物歧化酶和粘液的产生。

4.5 改善水质

益生菌不仅可以提高鱼类的免疫功能，还可以改善水质。Padmavathi 等[55]认为，益生菌可用作水产养殖业可持续发展的生物防治剂或生物修复剂，添加至重金属污染或藻类爆发的水环境中，可导致Pb、Cd、Hg、Ni 等重金属污染物减少，藻类生长减缓，起到了抑制病原体，增加营养素浓度、溶解氧浓度和水生有益细菌种群的效果[56,57]。

4.6 提供营养成分

作为食物添加剂，益生菌在肠道内降解时可提供β-葡聚糖等营养成分，与肠壁细胞核膜受体结合，产生信号传送至肠道细胞膜受体，促进转录蛋白的激活、免疫基因的表达、细胞因子的合成和分泌[5]。Gantner 等[58]发现，鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）和乳酸乳球菌使得小鼠（Mus musculus）的IL-1β 和TNF-α 基因表达上调。他们认为这或许与吞噬细胞中β-葡聚糖相关受体的存在有关。

4.7 益生菌与脑肠轴

哺乳动物的肠道和大脑存在肠-脑-肠的环路，具有调节小肠组织的局部生理活动、调控肠源性交感神经元活动，检测肠道微生物（如益生菌）及营养物质含量变化的作用[59-63]。改变肠道菌群组成能激活肠投射神经元，产生神经递质，调控宿主的行为[64]。Rosengren 等[65]利用重复压力限制测试，高压条件下的虹鳟肠道完整性降低，虹鳟端脑中盐皮质激素受体和血清素（一种神经递质）受体表达水平高；应激激素皮质醇是通过下丘脑-垂体-肾轴释放的、血清素参与鱼类的认知过程与行为反应。他们认为下丘脑-垂体-肾轴参与了脑-肠轴调控过程。根据Rosengren 等[65]研究可知虹鳟可能也存在相应的脑-肠轴调控机制，而对于虹鳟肠道益生菌与脑-肠轴的相互作用，今后应做进一步研究。

5 总结与展望

使用益生菌能够提高虹鳟生产性能、改善养殖水环境、增强机体免疫力，达到减少用药的目的。但是，虹鳟养殖中使用益生菌的研究报道较少，存在以下问题：1）性能稳定的益生菌种类不丰富，菌体抗逆性和安全性研究结果缺乏；2）益生菌的作用机理研究不够深入；3）高质量的益生菌产品（如饲料）需求大于市场供给；4）复合益生菌搭配不科学，特异性不强。为此，在虹鳟养殖中益生菌的研究可聚焦以下方面：1）重视益生菌的变异、质粒转移及耐药性等安全问题；运用高通量测序等技术手段分析菌群多样性，以充实益生菌资源库，提供优良益生菌候选菌株；2）探索益生菌的最适投饵策略，包括投饵量、投饵方式、投饵载体等，达到科学饲养、环保经济的目的；3）加大研究力度，深入揭示益生菌作用机理、益生菌与宿主的相互作用；4）规范益生菌的复合使用，使其符合科学、合理、绿色经济的理念；5）重视益生菌及代谢产物的研究，利用基因工程、发酵工程等技术提高益生菌代谢产物得率。