Cu2+、Cd2+对孔石莼（Ulva pertusa）吸收氮磷营养元素的影响

卢宏博，夏宁，冯传阳，魏海峰，刘长发

（1.大连海洋大学水产与生命学院，辽宁 大连 116023；2.辽宁省近岸海洋环境科学与技术重点实验室，辽宁 大连 116023；3.大连海洋大学农业农村部北方海水增养殖重点实验室，辽宁 大连 116023）

赤潮是海洋中微型浮游生物快速增殖、聚集，破坏生态系统结构与功能的一种生态异常现象[1]。赤潮的发生与沿岸海域富营养化的关系是人们关注的焦点问题之一[2-5]。海洋环境中氨氮含量的变动等不仅影响赤潮生物的生理生化组成，也决定了赤潮形成的规模和程度[6]。大型海藻吸收营养元素（N、P）的效率高，并具一定的经济效益，用大型海藻修复海洋富营养化和治理的技术，受到高度关注。

提高用大型海藻修复和治理水体环境的效果已成为发展海洋环境修复和治理技术的关键问题，我国加强了对大型藻吸收营养盐相关机理的探索与研究。胡章喜等[7]研究表明，海洋微藻能利用有机氮源，在无机氮缺乏而有机氮丰富的水体中，微藻有很强的竞争优势。王翔宇等[8]表明海藻对氮磷有明显的去除作用。吕冬伟等[9]研究了孔石莼Ulva pertusa 在不同浓度营养盐养殖废水中的净化作用，表现了良好的防治水体富营养化的应用前景。胡劲召等[10]认为，利用石莼处理养殖废时间短、效率高，可处理富营养化水体或养殖废水。张亮等[11]明确了不同存在形态的氮、氮磷比会影响藻类的光合速率和生长速率。张忠山等[12]综述了几种大型石莼属绿藻在不同环境因子胁迫下的生理生化特征变化及其调控机制，为近海海域环境治理提供科学了依据。

目前大多数研究主要集中在大型海藻对受N、P 污染富营养化海域的生物修复方面，证明海藻对各种重金属均有一定的富集能力[13]，且积累量随着海水重金属浓度的增加而增加，但关于重金属对海藻的毒性效应、致毒机理以及对重金属的耐受能力及修复机制等研究报道甚少。本实验着重研究了重金属Cu2+和Cd2+的胁迫对孔石莼吸收氮磷速率的影响，为今后利用孔石莼改善海洋环境、修复海洋富营养化提供科学理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用孔石莼采自大连市黑石礁海域，经室内培养一段时间，选取生长良好的部分用于实验。实验用海水为大连黑石礁海区砂滤海水，盐度31、pH 8.0～8.1。

实验所需主要药品为：三氯甲烷（分析纯）、磷酸二氢钾（分析纯）、氯化钠（分析纯）、硫酸铜（分析纯）、硫酸氨（分析纯）、f/2 配方（除氮磷以外的微量元素）。按照实验设定的时间间隔取适量水样进行保存和检测。

1.2 方法

实验在屋顶为半透明板材的实验室（22℃）中进行，自然光条件下用多瓶法和干扰法测定在Cu2+、Cd2+胁迫下孔石莼对氮磷营养元素（NH4+-N 和PO43--P）的吸收率[14]。

实验用盛水500 mL 的1 000 mL 烧杯中进行。以（NH4）2SO4为氮源，KH2PO4为磷源。NH4+-N 浓度梯度为：0 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L 和2.0 mg/L，N∶P＜16∶1，保证磷过量；PO43--P浓度梯度为：0 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L 和0.5 mg/L，N∶P＞16∶1，保证氮过量。每组浓度设置3 个平行，每个烧杯按1 mL/L 加入f/2 配方（除氮磷以外的微量元素），经室内培养驯化后的孔石莼，选取生长良好部分切成1 cm×1 cm，以1 g/L生物量投放于烧杯中，随后定量加入Cu2+和Cd2+，均设两个浓度0.5 mg/L 和1 mg/L，开始孔石莼对氮磷营养元素吸收实验。

实验从早上8：00 开始，持续12 h，期间采用自然光源，光照强度平均值为（4 000±500）lux。实验开始后0.25 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h 12 h 取样10 mL，置于冰箱保存。水样水质分析主要采用BRAN+LUBEE 公司的AutoAnalyzer3 型自动水质分析仪测定样品中氮磷的含量，温度用温度计直接读取。NH4+-N 和PO43--P 浓度分别采用靛酚蓝分光光度法和磷钼蓝分光光度法测定。

1.3 数据处理

采用SPSS25 统计软件和Excel 进行统计分析和数据处理，用t 检验法方差分析检测平均数之间的差异（P），以P＜0.05 作为差异的显著性水平。

2 结果与分析

2.1 无重金属胁迫下孔石莼对氮磷营养元素的吸收

如图1 所示，孔石莼对氮磷营养盐的平均吸收速率随营养盐浓度及吸收时间的变化而变化；其吸收符合三个阶段[15]，即快速吸收阶段（surge up take）、内部控制的吸收阶段（internally controlled up take）和外部控制的吸收阶段（externally controlled up take）三阶段。在0～15 min 内孔石莼对氮磷的吸收速度最快，30～720 min 内，吸收速率大幅下降，符合前人研究发现的规律。

图1 对照组孔石莼对氮磷营养盐的吸收速率Fig.1 Absorption rate of to nitrogen and phosphorus by sea lettuce Ulva pertusa in the control group

2.2 Cu2+胁迫下孔石莼对NH4+-N 的吸收

由图2 可知，在磷含量不受限制的情况下，0.5和1 mg/L Cu2+胁迫下，孔石莼吸收NH4+-N 的速率随着NH4+-N浓度的增加而增加，并随着Cu2+浓度的增加抑制率显著逐渐降低（P＜0.05）。

图2 在0.5 mg/L、1.0 mg/L Cu2+胁迫下孔石莼对NH4+-N营养盐的吸收速率Fig.2 Absorption rate of NH4+-N by sea lettuce Ulva pertusa exposed to stress of at 0.5 mg/L、1.0 mg/L Cu2+

在0.5 mg/L Cu2+胁迫下，孔石莼吸收氮的速率变化规律与对照组较为相似，可分为三个阶段，但吸收速率均有提高，相邻时间段的吸收速率差值较对照组减小；在1.0 mg/L Cu2+的胁迫下，在初始阶段（15～60 min）孔石莼对NH4+-N的吸收速率显著增加，与其他时间段的吸收速率趋于同步。在两个浓度的胁迫下，孔石莼对NH4+-N的吸收速率均可分为3 个阶段：第1 个阶段为快速吸收阶段（0～60 min），第2 个阶段为过渡阶段（120 min），第3 个阶段为缓慢吸收阶段（360～720 min）。魏海峰等[16]认为，吸收速率随时间而变化的原因可能是海藻处于NH4+-N限制时，开始的快速吸收是用于充盈细胞内营养库的阶段；吸收率下降至稳定阶段则是充盈细胞内NH4+-N的反馈抑制作用；接着是由介质营养盐浓度控制的吸收，随着介质营养盐的消耗，吸收速率迅速下降。

2.3 Cd2+胁迫下孔石莼对NH4+-N的吸收

如图3 所示，在磷不受限制的情况下，0.5 mg/L Cd2+的胁迫对孔石莼吸收NH4+-N的速率影响不明显。在1 mg/L Cd2+胁迫下，实验开始15 min 内孔石莼对NH4+-N吸收的速率显著加快，最大达9.3 mg/（g·h），但30～720 min 内吸收速率显著低于对照组，对孔石莼吸收NH4+-N速率已无明显影响，吸收速率一直控制在0.2 mg/（g·h）左右，并不随NH4+-N 初始浓度的提高而提高，Cd2+表现出了对孔石莼吸收NH4+-N的抑制作用，抑制率达到55.4%。朱喜锋等[17]研究表明，Cd2+对藻类的毒性作用主要在于Cd2+可以结合到生物大分子的活性位点，不仅能与酶活性中心的巯基结合，还能取代金属蛋白中的必需元素，导致生物大分子构象改变、酶活性丧失及必需元素缺乏，干扰细胞的正常代谢。镉可以使藻体发生氧化胁迫产生活性氧（ROS），影响藻体的光合作用器官和重要的酶活性，较长的Cd2+胁迫会显著降低石莼吸收NH4+-N的速率，影响藻类的正常生长。

图3 在0.5 mg/L、1.0 mg/L Cd2+胁迫下孔石莼对NH4+-N营养盐的吸收速率Fig.3 The absorption rate of NH4+-N by sea lettuce Ulva pertusa under 0.5 mg/L and 1.0 mg/L Cd2+stress

2.4 Cu2+、Cd2+胁迫下孔石莼对PO43--P 的吸收

如图4 所示，在低浓度PO43--P下，Cu2+对孔石莼吸收的抑制作用较为明显，PO43--P浓度在0.1～0.2 mg/L 时，孔石莼吸收PO43--P的速率为负值，PO43--P浓度为0.2 mg/L 及以上时，孔石莼吸收速率才为正值。张亮等[11]实验结果表明，藻稳定生长状态时，磷酸盐浓度必须高于0.2 mg/L，这与孔石莼对PO43--P的吸收在0.2 mg/L 为正值的现象相符合。以实验12 h 内的平均吸收速率观察，Cu2+对孔石莼吸收PO43--P速率受时间和浓度的影响较大，低浓度PO43--P条件下，孔石莼对PO43--P的吸收很少，甚至出现磷浓度增长现象，这与藻类受金属Cu2+胁迫释放磷有关。

图4 在1.0 mg/L Cu2+胁迫下孔石莼对PO43--P营养盐的吸收速率Fig.4 Absorption rate of PO43--P by sea lettuce Ulva pertusa under 1.0 mg/L Cu2+stress

如图5 所示，在0～60 min 内Cd2+对孔石莼吸收的抑制作用较为明显，60 min 以后，孔石莼吸收速率才有所加快，以12 h 内的平均吸收速率观察，Cd2+对孔石莼吸收PO43--P速率影响和Cu2+类似，也有很大影响，后期孔石莼对PO43--P的吸收速率接近于0.0523 mg/（g·h），抑制率为67.34%。

图5 在1.0 mg/L Cd2+胁迫下孔石莼对PO43--P营养盐的吸收速率Fig.5 Absorption rate of PO43--P by sea lettuce Ulva pertusa under 1.0 mg/L Cd2+stress

3 讨论

3.1 Cu2+、Cd2+胁迫下孔石莼对氮磷的吸收特点

在NH4+-N浓度为0.25～2.0 mg/L 时，对照组孔石莼对NH4+-N吸收速率在20.8～166 μg/（g·h）之间，呈快吸收现象，而在0.5 mg/L Cu2+胁迫下，平均吸收速率在19.1～126 μg/（g·h）；Cd2+胁迫下的平均吸收速率在20.6～157 μg/（g·h）之间；在Cu2+胁迫下孔石莼吸收NH4+-N的快吸收现象不明显。短时间内Cu2+（1.0 mg/L）、Cd2+（1.0 mg/L）对孔石莼吸收PO43--P的抑制作用也较强。Cu2+、Cd2+分别胁迫影响显著孔石莼对PO43--P吸收的动力学过程。本实验发现，磷酸盐含量出现比前一个时间段升高的情况。大量研究表明[20-22]，在细胞外金属离子会结合到细胞壁的多糖上，发生金属离子的排斥作用，或是改变细胞膜上金属离子的运输通道，使金属离子在细胞膜上改变价态、或转变成无毒性的有机金属化合物。

Cu2+对孔石莼吸收NH4+-N的影响比Cd2+强，抑制程度更大。同浓度的Cu2+、Cd2+胁迫下，1 mg/L Cu2+和Cd2+对不同起始浓度NH4+-N的最大抑制率分别为37.1%～55.4%和1.24%～9.68%，说明在本实验条件下Cu2+的毒性远大于Cd2+。朱喜锋[17]、张海波[18]研究表明，重金属显著影响海藻光合色素含量、光合作用、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶和硝酸还原酶（NR）活性及丙二醛（MDA）含量等生理生化指标，Cu2+的毒性效应相对弱一些，且低浓度Cu2+对藻体的生长有一定的促进作用；当其在较高浓度时抑制效应开始显现，叶绿素a、可溶性蛋白及甘露醇含量下降，过氧化物酶（POD）活性和丙二醛含量升高。Cd2+的胁迫作用没有Cu2+强，在高浓度、长时间作用下才表现出显著的抑制效应。

藻类对重金属胁迫是生理上一系列的响应，一些耐受性机理还尚不清楚，一些研究结果甚至不一致，因此需要进一步从分子水平、细胞水平及机体水平进行广泛深入研究。

3.2 Cu2+、Cd2+对藻类毒性作用的机理

Liu 等[19]和Wang 等[20]研究表明，Cu2+比较特殊，具有双重作用,既是藻类代谢必需的微量营养元素,又是有毒的重金属,其含量超过毒性效应阈值,对藻类的生长有较大的毒性。本实验中，Cu2+为藻类代谢必需的微量营养元素。林碧琴等[21]认为，在非致死浓度范围内（0.25～1.5 mg/L Cd2+），随Cd2+浓度增加强烈影响DNA 酶、脱氢酶和过氧化物酶活性，强烈抑制光合作用和细胞膜透性。但在本实验中，其胁迫效果并不明显，抑制率在10%以下，可能与大型藻具有解除金属毒性或增加其耐受力的机制有关。

重金属影响孔石莼吸收营养盐速率的机理有二：一种是重金属与酶蛋白的某些结合形成螯合物,使酶的结构与构型发生变化而影响酶的活性，使其吸收速率减慢[23]；二种可能是重金属的作用使作为酶的辅助因子的金属离子的吸收和利用受阻[24]。重金属抑制海藻营养代谢的原因是重金属能阻止海藻细胞分裂，破坏细胞内含物，降低酶的活性，产生抑制作用。魏海峰等[16]认为：重金属对藻类产生抑制作用的原因,还可能是重金属影响了藻类的酶活性。大型藻具有降低重金属毒性或增加自身耐受力的机制，藻类的胞外产物在细胞外结合金属离子，以达到解毒的作用。结合到细胞壁上的多糖可排斥金属离子，或改了细胞膜上金属离子的运输通道，细胞内的多糖可使金属离子改变价态或转变成无毒性的有机金属化合物，以达到解毒作用。